CAR NK-сells for the treatment of hematological malignancies: A review

Full Text

Введение

Гемобластозы включают в себя более 100 различных подтипов и вместе составляют около 4,8% всех опухолевых заболеваний в России [1]. С большей частотой они встречаются у пожилых людей [1]. Ожидается, что в будущем количество случаев заболевания будет расти из-за увеличения продолжительности жизни [2]. Традиционно схемы лечения гематологических злокачественных новообразований включали химио- и лучевую терапию, а также трансплантацию стволовых клеток. За последнее десятилетие за счет достижений в диагностике и терапии этих заболеваний получены существенные улучшения результатов лечения. К новым терапевтическим подходам относятся введение моноклональных антител [3–5] и иммуномодулирующих препаратов [6]. Тем не менее некоторые виды онкогематологических заболеваний по-прежнему имеют плохой прогноз. В последние годы перспективным подходом считается терапия на основе клеток [7–9]. Пациентам со злокачественным новообразованием вводят препарат в форме модифицированных или немодифицированных живых клеток от пациента или подходящего донора, которые способны специфически распознавать и разрушать злокачественные клетки. На данный момент наиболее изученными и применяемыми в клинической практике являются методы лечения на основе Т-лимфоцитов, модифицированных химерными антигенными рецепторами (CAR Т-клеток), которые показали отличные результаты в лечении различных типов гематологических опухолей [10–12]. Однако, несмотря на достигнутые успехи, CAR Т-клеточная терапия имеет определенные ограничения, обусловленные серьезными побочными эффектами, трудностями и высокой стоимостью производства CAR Т-клеток индивидуально для каждого пациента, невозможностью использования аллогенных продуктов и др. Данные проблемы могут быть решены путем внедрения CAR-технологий в другие клетки иммунной системы – натуральные киллеры (NK-клетки) [13].

В последние годы проводятся исследования CAR NK-клеточной терапии в моделях на животных, а также появляются небольшие клинические исследования. Структура и целевые антигены CAR NK-клеток обычно подобны таковым для CAR Т-клеток [14]. Однако важно отметить, что CAR NK-клетки, по-видимому, имеют много преимуществ по сравнению с CAR T-клетками. Например, аллогенные NK-клетки могут использоваться в качестве эффекторных клеток, поскольку они не вызывают реакцию «трансплантат против хозяина». Кроме того, CAR NK-клетки могут быть безопаснее, чем CAR T-клетки: отсутствие серьезных токсических эффектов данной терапии показано во многих исследованиях [14].

В данном обзоре будут рассмотрены данные современных исследований CAR NK-клеток в терапии гематологических новообразований.

Основные особенности NK-клеток. Химерный антигенный рецептор (CAR)

NK-клетки – эффекторные клетки врожденного иммунитета, играющие важную роль в уничтожении как клеток, инфицированных вирусом, так и опухолевых клеток [15]. NK-клетки составляют 5–15% лейкоцитов периферической крови человека и обычно идентифицируются по экспрессии CD56 без совместной экспрессии CD3 и Т-клеточного рецептора [16].

В проведенных исследованиях показано, что NK-клетки проявляют мощный противоопухолевый иммунитет с помощью множества механизмов. Они функционально подобны цитотоксическим CD8+T-клеткам и убивают клетки-мишени с помощью аналогичных цитотоксических механизмов, но в отличие от Т-клеток NK-клетки не распознают клетки-мишени через антиген-специфические рецепторы [17]. Активация цитотоксической активности NK-клеток контролируется сигналами от активирующих и ингибирующих рецепторов на их поверхности [13, 18]. К ним относятся ингибирующие иммуноглобулин-подобные рецепторы – KIR (KIR-2DL и KIR-3DL) и B1 (LILRB1), активирующие рецепторы естественной цитотоксичности (NKp46, NKp30 и NKp44) [13]. Таким образом, уничтожение клетки-мишени NK-клеткой зависит от баланса между тормозными и активирующими сигналами. После активации NK-клетки лизируют опухолевые клетки путем высвобождения цитотоксических молекул перфорина и гранзима [13].

NK-клетки также задействованы в механизме антитело- зависимой клеточной цитотоксичности, при которой антитела, связанные с клетками-мишенями, активируют цитотоксичность NK-клеток [19]. NK-клетки экспрессируют CD16, который распознает Fc фрагмент иммуноглобулина G, связанный с поверхностью клетки-мишени. Это взаимодействие активирует цитотоксическую функцию NK-клеток. Помимо своей роли в качестве цитотоксических эффекторных клеток активированные NK-клетки также секретируют различные воспалительные цитокины и хемокины, которые в свою очередь привлекают и активируют другие иммунные клетки, такие как Т-клетки, дендритные клетки и макрофаги [20].

В 2006 г. обнаружено, что NK-клетки обладают способностью иммунологической памяти: подобно клеткам адаптивного иммунитета они распознают и уничтожают патогены в ответ на их повторное попадание в организм [13]. Обычно такие клетки экспрессируют высокие уровни NKG2C и обладают способностью к длительной пролиферации и персистенции in vivo [21]. NK-клетки памяти также можно характеризовать как клетки, обладающие высоким уровнем цитотоксической активности. В системе in vitro получение клеток, обладающих подобными характеристиками, возможно при создании оптимальных условий культивирования с использованием различных ростовых факторов, активирующих пролиферативную и цитотоксическую активность натуральных киллеров [13].

Однако, несмотря на наличие мощных противоопухолевых свойств NK-клеток, клинический эффект от их введения остается неоправданно низким [13], что в свою очередь может быть отчасти обусловлено влиянием микроокружения опухоли. Накопленные данные показали, что проникающие в опухоль NK-клетки проявляют слабую цитотоксическую способность, сопровождаемую подавлением активирующих рецепторов и повышением активности ингибирующих рецепторов по сравнению с NK-клетками в неопухолевых тканях [22, 23]. Пролиферация NK-клеток и противоопухолевая активность подавляются секрецией опухолевыми клетками различных иммуносупрессивных факторов, а также регуляторными Т-клетками из микроокружения опухоли. Высокие уровни ингибирующих молекул, включая лиганды запрограммированной смерти PD-L1 или PD-L2, экспрессируемые на опухолевых клетках, антигенпрезентирующих клетках, иммуносупрессивных клетках и стромальных клетках в микроокружении опухоли, предотвращают активацию NK-клеток, что приводит к их истощению и дисфункции [24].

Для усиления специфической активности NK-клеток применяются CAR-технологии, а также комбинированная терапия с использованием блокады иммунных контрольных точек или подавления ингибирующих рецепторов NK-клеток.

CAR-технология базируется на создании клеток, несущих химерный антигенный рецептор (CAR), селективно узнающий антигены на поверхности опухолевой клетки (рис. 1). CAR представляет собой искусственно модифицированный гибридный белок, основанный на Т-клеточном рецепторе, который состоит из внеклеточного домена распознавания антигена, слитого с множеством внутриклеточных сигнальных доменов. Внеклеточный домен CAR обычно представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела (scFv), который распознает специфический антиген (обычно сверхэкспрессируемый на опухолевых клетках или уникальный для них) без презентации молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC), подобно антителу. Внутриклеточные домены обычно содержат CD3ζ, CD28, 4-1BB и предназначены для увеличения активации NK-клеток [25].

 

Рис. 1. Химерный антигенный рецептор – CAR. / Fig. 1. Chimeric antigen receptor – CAR.

 

Специфическими мишенями для CAR NK-клеток обычно являются CD19, CD20, CD33, CD7 и CD138 [25].

Преимущества и недостатки использования NK-клеток для CAR-терапии

Несмотря на то что NK-клетки являются привлекательным источником эффекторных клеток для иммунотерапии новообразований, использование NK-клеток для CAR-терапии ограничено. Вероятно, это связано с рядом недостатков, которые NK-клетки имеют по сравнению с T-клетками для использования в CAR-терапии. Во-первых, количество NK-клеток в периферической крови относительно низкое и NK-клетки намного сложнее размножаются in vitro, поскольку количество клеточных делений, которым они могут подвергнуться, ограничено. Это затрудняет получение достаточного количества аутологичных NK-клеток, необходимых для инфузии [26, 27]. Кроме того, почти полное отсутствие формирования памяти и короткая продолжительность жизни этих клеток препятствуют долговечности ответа [26, 27]. Важным недостатком использования CAR NK-клеток является также тот факт, что трудно их получить и манипулировать ими: по сравнению с Т-клетками NK-клетки довольно устойчивы к генной инженерии [14, 28].

Для преодоления этих сложностей проведены различные исследования. Показано, что цитокины интерлейкин (ИЛ)-12, ИЛ-15 и ИЛ-18 могут побуждать NK-клетки к дифференцировке в NK-клетки памяти, которые имеют более длительную продолжительность жизни in vivo [29]. А благодаря последним достижениям и разработкам клинически совместимых методов экспансии и генетического манипулирования NK-клетками CAR NK-терапия может иметь большой потенциал в качестве новой иммунотерапии злокачественных новообразований. Это объясняется еще и тем, что использование NK-клеток имеет ряд преимуществ по сравнению с использованием Т-клеток. Во-первых, риск развития синдрома высвобождения цитокинов, наиболее серьезного побочного эффекта CAR Т-клеточной терапии [30], значительно ниже при использовании NK-клеток из-за разницы цитокинов, которые они продуцируют, и их более низкой скорости экспансии [26, 27]. Во-вторых, потенциальные побочные эффекты от CAR-терапии NK-клетками будут относительно короткими из-за уменьшенной продолжительности жизни NK-клеток. В-третьих, CAR NK-клетки не зависят только от конструкции CAR для распознавания опухолевых клеток, но также могут активироваться посредством других активирующих рецепторов природной цитотоксичности и вызывать гибель клеток-мишеней независимо от опухолевого антигена, тогда как Т-лимфоциты убивают свои мишени только с помощью CAR-специфического механизма. Следовательно, в условиях подавления антигена опухолевыми клетками, пытающимися избежать иммунного обнаружения, NK-клетки все еще будут эффективны против опухолевых клеток. Например, экспрессия CD16, опосредующая антителозависимую клеточную цитотоксичность CAR NK-клеток, представляет собой дополнительную стратегию уничтожения опухолей, а также ведет к возможности комбинированной терапии с моноклональными антителами [20, 31]. Наконец, CAR NK-клетки можно использовать в виде аллогенных материалов, поскольку перенос аллогенных NK-клеток не приводит к реакции «трансплантат против хозяина» [32]. Возможность производства готового к употреблению продукта на основе CAR NK-клеток для универсального лечения пациентов могла бы значительно увеличить скорость введения, эффективно сокращая время задержки от принятия решения о лечении до первого приема препарата. В связи с отсутствием серьезных токсических эффектов при терапии CAR NK-клетками лечение можно проводить с последующим наблюдением амбулаторно, что значительно снижает огромные косвенные затраты, связанные с терапией CAR T-клетками из-за длительной госпитализации после инфузии [33].

Данные об эффективности и безопасности CAR NK-клеточной терапии при гематологических новообразованиях

Недавний метаанализ текущих клинических испытаний по всему миру выявил 520 активных испытаний, в которых изучались в общей сложности 64 различных CAR, причем 96,4% испытаний использовали CAR T-клетки [34]. Следовательно, в настоящее время область изучения CAR NK-клеток все еще находится в зачаточном состоянии с точки зрения перевода лабораторных исследований в клинические испытания. Некоторые из испытаний CAR NK-клеток сосредоточены на лимфоме и лейкемии, другие нацелены на солидные опухоли.

Нами найдено всего 2 опубликованные работы, описывающие результаты клинических испытаний CAR NK-клеток для терапии гематологических новообразований. В работе X. Tang и соавт. [35] сообщается о небольшом исследовании пациентов с рецидивирующей и рефрактерной формой острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). Использована конструкция CAR III поколения, содержащая 2 костимулирующие молекулы: CD28 и 4-1BB. Данное исследование I фазы не продемонстрировало очевидной клинической эффективности, однако это первое клиническое испытание на людях показало, что данную терапию можно безопасно использовать у пациентов с рецидивирующей и рефрактерной формой ОМЛ с высокой опухолевой нагрузкой.

Первое крупномасштабное клиническое испытание I/II фазы проведено совсем недавно и опубликовано в феврале 2020 г. [36]. Одиннадцать пациентов с рецидивирующим или рефрактерным хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ) или неходжкинской лимфомой (НХЛ) получали продукт аллогенных CAR NK-клеток, выделенных из пуповинной крови, после прохождения химиотерапии, сопровождающейся лимфодеплецией, на основе циклофосфамида/флударабина. Хотя донорские NK-клетки первоначально выбраны на основе частичного совпадения HLA, из-за отсутствия реакции «трансплантат против хозяина» доноров для 2 последних пациентов выбирали без учета HLA-соответствия.

Для решения проблемы короткой продолжительности жизни CAR NK-клеток in vivo авторы исследования сконструировали NK-клетки, экспрессирующие ИЛ-15 [37]. Таким образом, трансдуцированные CAR клетки продуцировали собственный растворимый ИЛ-15, которого оказалось достаточно для поддержания автономного роста в течение 42 дней. Предотвращая возможность серьезных побочных эффектов, авторы также включили индуцибельный суицидный ген, называемый индуцибельной каспазой 9, в качестве меры безопасности.

Короткое время производства CAR-продукта позволило каждому пациенту получить индивидуально изготовленный клинический продукт в течение 2 нед после включения в клиническое исследование. Так, 8 (73%) из 11 пациентов ответили на лечение, у 7 пациентов (4 с лимфомой и 3 с ХЛЛ) достигнута полная ремиссия.

Введение CAR NK-клеток не было связано с развитием синдрома высвобождения цитокинов, нейротоксичности, реакции «трансплантат против хозяина» или других серьезных токсических эффектов, а также не наблюдалось повышения уровней воспалительных цитокинов, включая ИЛ-6, по сравнению с исходным уровнем. Максимально переносимая доза не была достигнута. Ответы являлись быстрыми и наблюдались в течение 30 дней после инфузии. Количество инфузированных CAR NK-клеток увеличивалось в первые 3–14 дней после инфузии, а затем сохранялось на низком уровне не менее 12 мес.

Длительность ответа на CAR NK-клеточную терапию не могла быть оценена, поскольку после первых 30 дней терапии была разрешена терапия консолидации ремиссии. Однако очевидно, что, учитывая тяжесть заболевания и несколько циклов неудачной химиотерапии (3–11), которым эти пациенты ранее подвергались, показатель ответа 8 из 11 пациентов является огромным успехом.

Основные характеристики и результаты описанных исследований сведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Основные характеристики и результаты клинических исследований CAR NK-клеток для терапии гемобластозов / Table 1. Main characteristics and results of CAR NK cells clinical studies for the treatment of hematological malignancies
Заболевание	Число пациентов	Источник NK-клеток	Мишень для CAR NK-клеток	Костимулирующие и другие дополнительные домены в CAR	Побочные эффекты	Эффективность	Источник
ОМЛ	3	линия NK-92	CD33	CD28 и 4-1BB	Повышение температуры (38,5–40°C), СВЦ 1-й степени тяжести	Не продемонстрировано очевидной клинической эффективности	[35]
НХЛ или ХЛЛ	11	Пуповинная кровь	CD19	CD28, ИЛ-15 и индуцибельная каспаза 9	Не зарегистрировано развития серьезных токсических эффектов. Ни у одного из пациентов не наблюдалось симптомов СВЦ, нейротоксичности	При среднем сроке наблюдения 13,8 мес объективный ответ получен у 73% пациентов, в том числе у 64% пациентов достигнута полная ремиссия	[36]
Примечание. СВЦ – синдром высвобождения цитокинов.

 

Стратегии повышения эффективности терапии CAR NK-клетками

Несмотря на огромный потенциал CAR NK-клеточной терапии, все еще существуют фундаментальные проблемы, которые необходимо решить для расширения ее клинического применения. Во-первых, существующие CAR разработаны для создания CAR T-клеток и как таковые являются неоптимальным выбором для применения к NK-клеткам. Уже ведутся исследования в этом направлении. Так, в работе Y. Li и соавт. [38] представлены конструкции CAR, оптимизированные для активации и цитотоксичности именно NK-клеток.

Во-вторых, проблемы генетической инженерии первичных NK-клеток привели к проведению многих исследований и клинических испытаний с NK-клетками линии клеток NK-92. Разработка новых методов и оптимизация существующих технологий будут способствовать более эффективной генной инженерии первичных NK-клеток [39]. Так, например, недавно описана инновационная стратегия создания CAR NK-клеток с использованием периферической крови в качестве источника [40].

В-третьих, NK-клетки чувствительны к процессу замораживания-оттаивания. После оттаивания выживаемость и цитотоксичность NK-клеток значительно снижаются [41]. Некоторые команды исследователей обнаружили, что активность замороженных NK-клеток может быть частично восстановлена путем добавления ИЛ-2 [42]. Таким образом, необходимо изучить стратегии оптимальной криоконсервации, чтобы можно было производить готовые продукты CAR NK-клеточной терапии.

Наконец, аллогенные NK-клетки могут быть загрязнены Т-клетками, что приводит к реакции «трансплантат против хозяина» или лимфопролиферативным нарушениям [43]. Следовательно, необходимо установить лучшие клинические протоколы очистки NK-клеток, которые в конечном итоге будут безопасны для пациентов.

Для повышения эффективности CAR NK-клеточной терапии возможно ее комбинирование с терапией моноклональными антителами с целью использования как целенаправленного лизиса, так и антителозависимой цитотоксичности [39]. Кроме того, использование блокады иммунных контрольных точек или введение CAR с одновременным подавлением ингибирующих рецепторов NK-клеток (таких как NKG2A или TIM-3) для преодоления иммуносупрессивного эффекта в микроокружении опухоли может повысить противоопухолевую способность CAR NK-клеток [21].

Заключение

В последние годы повышенное внимание уделяется CAR NK-клеточной терапии опухолевых заболеваний. Существующие доклинические и клинические данные говорят об эффективности и безопасности данной терапии. Использование CAR NK-клеток может оказаться успешным в особенности из-за отсутствия серьезных побочных эффектов и возможности использования готовых аллогенных продуктов. Однако данный подход является недавней концепцией и, следовательно, нуждается в дальнейшем улучшении для преодоления существующих проблем.

Раскрытие интересов. Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The author declares that she has no competing interests.

Вклад автора. Автор декларирует соответствие своего авторства международным критериям ICMJE.

Author’s contribution. The author declares the compliance of her authorship according to the international ICMJE criteria.

Источник финансирования. Автор декларирует отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The author declares that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Благодарности. Выражаю огромную благодарность проф. А.А. Завьялову за ценные комментарии, данные им в процессе подготовки рукописи.

Acknowledgements. I express my gratitude to Prof. A.A. Zavyalov for his valuable comments during the preparation of the manuscript.

About the authors

Irina V. Gribkova

Research Institute for Healthcare Organization and Medical Management of Moscow Healthcare Department

Author for correspondence.
Email: igribkova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7757-318X
SPIN-code: 1559-3870
Scopus Author ID: 6603351859

Cand. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files