Detection and monitoring of minimal residual disease in acute megakaryoblastic leukemia in children

Cover Page

Abstract


Acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) is a rare subtype of acute myeloid leukemia (AML), which is associated with poor prognosis for all patients except children with t(1;22) or Down syndrome. The frequency of complete remission in case of AMKL is comparable to the frequency of complete remission in other variants of AML, and the median survival is much lower. This determines the necessity to update criteria for assessment of the effect of treatment using flow cytometry definition of the level of minimal residual disease (MRD). Nowadays, there are no unified and standardized approaches for the measurement of MRD in case of myeloid leukemia, including AMKL, which prohibits adequate assessment of the therapy effect and in some cases – determination of the indications for allogeneic hematopoietic stem cells transplantation. The article identifies diagnostic features and describes approaches for the measurement of the level of MRD in case of AMKL.

Aim. The aim is to demonstrate the algorithms for diagnosing and measuring MRD in case of AML-M7 in children.

Materials and methods. The article analyzes the clinical and immunological profile of 10 boys and 4 girls with the initial diagnosis of AMKL between the ages of 3 months – 12 years old, 13 of them have received treatment in the FSBI «N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology» and one – in the GBUZ «Morozovsky DGKB» between 1995 and 2020, The measurement of MRD was carried out in 6 patients. The measurement of MRD was carried out using both morphocytochemical method and multiparameter flow cytometry with megakaryocyte markers (CD61, CD42, CD41) in combination with other myeloid markers (CD13, CD33), CD34, CD117 and aberrant markers (mainly CD7).

Results. We showed that adequate measurement of the level of MRD had required detailed immunophenotyping during diagnosis to determine the aberration of megakaryoblasts. CD9 marker (100%), CD33 myeloid marker (69.2%), stem cell antigen CD34 (46.2%), CD13 (38.2%) in addition to megakaryocyte markers (100%) were most often expressed on blast cells in case of AMKL. The CD117 antigen was present on the blasts in 33.3% of cases. The expression of the T-cell-associated CD7 antigen (46.2%) was frequent. The measurement of MRD was carried out during the treatment (usually after an induction course) on the basis of the markers of megakaryocytic cell line (CD61, CD41, CD42a, CD42b), weak CD45 expression, as well as the immunophenotype characteristics during initial diagnosis. The level of MRD ranged from completely negative (0%; 0.006%) to evident (1.05%).

Conclusion. The detection of residual tumor megakaryoblasts in case of AML-M7 using flow cytometry is a promising method to evaluate the effect of therapy. The adequate measurement of the level of MRD requires detailed immunophenotyping during the diagnosis to determine the aberration of megakaryoblasts.


Full Text

Введение

Острый мегакариобластный лейкоз (ОМегЛ) является биологически неоднородным морфологическим вариантом острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) и развивается из мегакариоцитарных предшественников. ОМегЛ впервые описан в 1931 г. J. von Boros [1, 2], однако в последующие годы сообщения о данном типе лейкоза редки в связи с отсутствием достоверных диагностических критериев. В 1978 г. J. Breton-Gorius и соавт. [3] впервые применили технологию ультраструктурной идентификации с использованием тромбоцитарной пероксидазы, которая позволила выявить малые мегакариоциты и увеличить точность диагностики ОМегЛ. Далее в 1985 г. диагноз ОМегЛ с уточненными диагностическими критериями внесен во Франко-Американо-Британскую классификацию [4].

ОМегЛ является сложным для установления диагнозом. Его морфологические признаки недостаточно специфичны, так как бластные клетки морфологически могут быть как неотличимы от лимфобластов, так и характеризоваться выраженной базофилией и отростчатостью цитоплазмы [5]. Цитохимически в бластных клетках при этом заболевании отсутствует миелопероксидаза, а гликоген располагается в цитоплазме в форме гранул, что также является цитохимическими признаками лимфобластного лейкоза [5, 6]. Наиболее специфичным цитохимическим признаком ОМегЛ считается тромбоцитарная пероксидаза: для ее выявления необходима электронная микроскопия в сочетании с ультрацитохимическим исследованием, которые позволяют выявить положительную реакцию с тромбоцитарной пероксидазой в оболочке ядра и эндоплазматическом ретикулуме опухолевых мегакариобластов [7]. Достоверное установление диагноза ОМегЛ возможно только при полноценном иммунофенотипировании с использованием Т- и В-лимфоидных, мегакариоцитарных, эритроидных и пан-миелоидных маркеров. В педиатрической практике ОМегЛ наиболее часто встречается у детей до 1–3 лет, а также у детей с синдромом Дауна [2].

Пролиферирующие мегакариобласты синтезируют тромбоцитарный фактор роста PDGF-ВВ, а также некоторые другие факторы роста фибробластов, что приводит к выраженным реактивным фибротическим изменениям стромы костного мозга. Эти изменения препятствуют адекватной аспирации костного мозга при пункции, полученные пунктаты зачастую имеют недостаточный объем и клеточность, а пропорция в них бластных клеток может быть занижена. Фиброз костного мозга вкупе с особенностями кроветворения детей 1–2-го года жизни обусловливает сравнительно низкий процент опухолевых бластных клеток в костном мозге и трудности диагностики при ОМегЛ [8–10].

Цитогенетические особенности М7-варианта ОМЛ

До недавнего времени для этого варианта ОМЛ выделяли только одну специфическую цитогенетическую аномалию: наличие t(1;22)(p13;q13) в бластных клетках, в результате которой образуется химерный ген RBM15-MKL1, чаще всего эта транслокация обнаруживается у пациентов в возрасте до 2 лет. Наличие этой аномалии рядом исследователей признается как благоприятный прогностический признак [9, 11, 12]. Однако в последние годы с появлением метода полногеномного секвенирования обнаружены другие цитогенетические поломки, характерные для ОМегЛ: это inv(16)(p13.3q24.3), t(11;15)(p15;q35), реаранжировки гена KMT2A и др. Эти аномалии имеют различные частоту выявления и прогностическое значение [8]. Также в опухолевых клетках при ОМегЛ могут встречаться и другие цитогенетические поломки, неспецифичные для этого заболевания, например, моносомия хромосомы 5, 7, 9, гипердиплоидный, сложный кариотип. Наличие таких хромосомных аномалий является дополнительным фактором плохого прогноза.

Следовательно, с учетом морфологических, цитохимических, иммунологических и цитогенетических особенностей ОМегЛ нельзя рассматривать как мономорфную нозологическую единицу, что нашло отражение в классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения (2016 г.). В соответствии с данной классификацией к ОМегЛ относятся: ОМЛ (мегакариобластный) с транслокацией t(1;22)(p13.3;q13.1);RBM15-MKL1, с инверсией inv(3)(q21.3;q26.2), c транслокацией t(3;3)(q21.3;q26.2), с транслокацией t(9;11)(p21.3;q23.3);KMT2A-MLLT3 [5, 13].

По оценке исследовательских групп, частота достижения полной ремиссии (ПР) при ОМегЛ у детей составляет 70–80%, что сравнимо с другими вариантами ОМЛ; однако медиана общей выживаемости значительно ниже, чем при других вариантах ОМЛ [9, 14, 15]. Это диктует необходимость более эффективной, чем клинико-морфологическая, оценки глубины ремиссии при ОМегЛ, в том числе с применением проточно-цитометрической оценки минимальной остаточной болезни (МОБ). Для введения этого метода в практику необходимы установление алгоритма определения МОБ, критериев позитивности МОБ и оценка влияния полученных количеств остаточных опухолевых клеток на прогноз заболевания. Также такой низкий уровень общей выживаемости означает необходимость повышения эффективности существующей терапии консолидации ремиссии с возможным применением метода аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Измерение МОБ необходимо при оценке статуса заболевания перед аллогенной трансплантацией костного мозга (аллоТКМ), а также в установленные сроки после ее выполнения (30, 60, 100, 180, 360-й дни), однако единые стандартизованные подходы к измерению МОБ при ОМЛ, в том числе при ОМегЛ, отсутствуют, что препятствует адекватной оценке эффективности лечения.

В настоящей статье на основании характеристики 14 случаев ОМегЛ описаны критерии диагностики и оценки МОБ при ОМегЛ.

Материалы и методы

В нашей работе проанализированы данные 14 детей с впервые выявленным ОМегЛ: 10 мальчиков и 4 девочки в возрасте от 3 мес до 12 лет (6 пациентов младше 1 года), 13 из них получали лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» и 1 – в ГБУЗ «Морозовская ДГКБ» с период с 1995 по 2020 г.

Уровень лейкоцитов крови находился в пределах 2,5–53,0×109/л, бластные клетки в костном мозге 20,2 – 90%.

Цитогенетическое исследование проводилось 10 пациентам. У 2 пациентов выявлена транслокация t(1;22). У 3 пациентов определялись различные варианты химерного гена MLL: 46XY?, t(10;11)(p11q23)[14]/46XY[6], t(10:11) MLL/MLLT10 и t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9. У 4 пациентов определялся сложный кариотип: 45XY,-7, t(3;3)(q21q26), 48XY,+21,+21, der(17), 53XX,t(1;7)(q21;p15),der(1),+2,+6,+7,+7,der(7)t(1;7),+8,+10, +19[8]/46,XX[10] и 50,XX,+6,+7,+8, +13, der(11), add(p15), del(17)(q24.). У 1 пациента цитогенетические аномалии не выявлены: 46XY.

Cледовательно, в соответствии с классификацией опухолей кроветворной и лимфоидной тканей Всемирной организации здравоохранения (2016 г.) у 2 больных диагностирован ОМЛ (мегакариобластный) с транслокацией t(1;22)(p13.3;q13.1); у 2 – ОМЛ с транслокацией t(10;11); у 1 – ОМЛ с транслокацией t(9;11); у 4 – ОМЛ с комплексным (сложным) кариотипом и у 1 больного – ОМЛ с нормальным кариотипом.

При проведении диагностики всем больным осуществляли подробное иммунофенотипирование бластных клеток. В основе подхода лежит концепция EuroFlow [16], которая включает оценку линейности лейкоза по ориентационной пробе ALOT с последующим анализом бластных клеток согласно их линейной принадлежности (табл. 1).

 

Таблица 1. Основная панель моноклональных антител, использованных в работе

Table 1. The main panel of monoclonal antibodies used in the study

Флуорохромы

№ пробы

V450

V500

F

PE

PE-cy5

PEcy7

APC

APCH7

1

HLA-DR

CD45

CD16*

CD13

CD34

CD117

CD11b

CD10

2

HLA-DR

CD45

CD35

CD64

CD34

CD117

CD300e

CD14

3

HLA-DR

CD45

CD36

CD105

CD34

CD117

CD33

CD71

4

HLA-DR

CD45

nuTdT

CD56

CD34

CD117

CD7

CD19

5

HLA-DR

CD45

CD15

NG2

CD34

CD117

CD22

CD38

6

HLA-DR

CD45

CD42a/CD61

CD203c

CD34

CD117

CD123

CD4

7

HLA-DR

CD45

CD41

CD25

CD34

CD117

CD42b

CD9

*Антитела, специфичные к указанным кластерам дифференцировки.

*Antibodies specific to the specified differentiation clusters.

 

Большинство пациентов (8 из 14) получали лечение по протоколу НИИ ДОГ ОМЛ 2012; 3 – по AML-BFM 87 и 3 – по AML-BFM 2004. Протоколы НИИ ДОГ ОМЛ 2012 и AML-BFM 2004 состояли из 4–5 курсов химиотерапии (ХТ). У пациентов, включенных в группы промежуточного и высокого рисков, ХТ включала 5 курсов: AIE (Ara-C, IDA, этопозид), НАМ (Ara-C 3000 мг/м2 №6, митоксантрон), AI (Ara-C 500 мг/м2 1–5-й дни и IDA), hAM (Ara-C 1000 мг/м2 и мито-ксантрон) и НАЕ (Ara-C 3000 мг/м2 №6 и этопозид). Поддерживающая терапия состояла из постоянного приема 6-меркаптопурина, четырехдневных курсов Ara-C 1 раз в 28 дней и длилась до 73-й недели от начала индуктивного курса. В отличие от протокола AML-BFM 2004 в протоколе НИИ ДОГ ОМЛ 2012 наряду с ХТ применялось эпигенетическое лечение (децитабин, вальпроевая и полностью транс-ретиноевая кислота – ATRA).

Протокол AML-BFM 87 состоял из: индукции ремиссии длительностью 8 дней, включавшей Ara-C 100 мг/м2 в сутки внутривенно капельно 24 ч в 1–2-й дни, 100 мг/м2 внутривенно капельно в течение 1 ч каждые 12 ч в 3–8-й дни, даунорубицин 60 мг/м2 в сутки внутривенно капельно 1 ч в 3–5-й дни и вепезид (VP-16) 150 мг/м2 в сутки внутривенно капельно 2 ч в 6–8-й дни; консолидации ремиссии – Ara-C 75 мг/м2 в сутки внутривенно струйно в 3–6-й, 10–13-й, 17–20-й и 24–27-й дни, даунорубицин 30 мг/м2 в сутки внутривенно капельно в течение 2 ч в 1, 8, 15 и 22-й дни, 6-МП 60 мг/м2 в сутки внутрь ежедневно в 1–27-й дни; и 2 курсов ранней интенсификации – Ara-C 1000 мг/м2 внутривенно капельно каждые 12 ч в 1–3-й дни и VP-16 125 мг/м2 в сутки внутривенно капельно в 2–5-й дни.

С целью консолидации полученной ремиссии 2 пациентам проведена аллоТКМ.

Результаты

Диагноз ОМегЛ во всех случаях установлен на основании детального морфологического, цитохимического и иммунофенотипического обследования.

Костный мозг чаще средне- или гипоклеточный. По данным морфоцитохимического исследования выявлялось более 20% бластных клеток (от 20,2 до 90%, среднее количество составило 48). В большинстве случаев бластные клетки имели неправильные очертания и отростчатую цитоплазму, умеренное и высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, округлые ядра; цитоплазма характеризовалась базофилией и отсутствием зернистости. Однако в нескольких случаях бластные клетки не имели специфических морфологических признаков дифференцировки при морфологическом исследовании.

Для верификации диагноза ОМегЛ использовали антитела к мегакариоцитарным антигенам: СD61 (практически всегда в сочетании с CD42a), CD41a, CD42b. Следует отметить, что реакция с антителами к CD42b отрицательная лишь в 1 из 6 случаев, в этом случае положительная реакция отмечена с антителами к CD61+CD42a и CD41. В 1 случае антитела к CD61 не использовали, при этом отмечена положительная реакция с CD42b – 30%.

Как видно из данных, представленных в табл. 2, экспрессия мегакариоцитарных антигенов на бластных клетках наиболее часто сочеталась с экспрессией общемиелоидных антигенов (CD33 – 9/13, CD13 – 5/13), маркера стволовых клеток (CD34 – 6/13), CD9 – 6/6. Необходимо отметить, что в 6 из 13 изученных случаев на бластных клетках присутствовал Т-клеточно-ассоциированный антиген CD7. Маркер СD117 обнаружен в 1/3 случаев – 3/9.

 

Таблица 2. Иммунофенотипы пациентов, включенных в исследование

Table 2. Immunophenotypes of patients included in the study

Маркер

Пациент

Сводное количество (+/всего)

Процент позитивных

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

МРО

   

-

 

-

-

 

-

 

-

   

0/5

0

CD34

+

+

-

+

-

-

-

-

-

+

+

-

+

 

6/13

46,2

CD117

  

-

+

-

-

-

-

-

+

+

   

3/9

33,3

CD13

+

+

-

-

+

-

-

-

-

+

+

 

-

-

5/13

38,5

CD33

+

+

-

-

+

+

+

-

+

+

+

 

+

-

9/13

69,2

CD64

-

-

 

-

 

-

-

-

-

 

-

   

0/8

0

CD4

   

-

 

-

-

  

-

 

-

-

 

0/7

0

CD7

+

-

-

+

 

+

+

+

-

-

+

-

-

-

6/13

46,2

HLA-DR

+

-

-

-

-

-

-

+

 

-

-

+

+

-

4/13

30,8

CD9

  

+

+

+

+

+

  

+

    

6/6

100

CD56

-

 

-

-

 

-

-

  

+

    

1/6

16,7

CD38

+

  

-

-

-

-

+

   

+

+

 

4/8

50

GPA

-

-

     

-

-

 

-

 

-

 

0/6

0

CD36

   

-

 

-

+

  

-

    

1/4

25

CD105

   

-

 

-

-

       

0/3

0

CD(61+42a)/CD61

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

 

+

13/13

100

CD41

  

+

+

 

+

+

       

4/4

100

CD42b

  

+

+

 

-

+

+

    

+

 

5/6

83,3

CD71

     

+

-

  

-

    

1/3

33,3

CD22

-

-

-

   

-

   

-

-

 

-

0/7

0

TdT

   

-

-

-

-

       

0/4

0

CD11b

   

+

 

-

-

  

-

 

-

-

 

1/6

16,7

CD123

  

-

+

-

-

-

  

-

    

1/6

16,7

 

 

Совокупность иммунофенотипов у больных ОМегЛ представлена в табл. 2.

Наиболее интересные иммунофенотипы с признаками аберрантности, позволяющими мониторировать МОБ у больных, представлены на рис. 1–3.

Следует отметить, что у отдельных больных наряду с мегакариобластами присутствовала достаточно выраженная пропорция В-линейных предшественников. Эти клетки ни в одном из случаев не имели признаков аберрантности и расценены как нормальные В-линейные предшественники.

 

Рис. 1. Коэкспрессия CD7 на бластной популяции при ОМегЛ.

Fig. 1. CD7 coexpression on the blast cell population in case of acute megakaryoblastic leukemia (AMKL).

 

Рис. 2. Коэкспрессия антигена CD56 на бластной популяции при ОМегЛ.

Fig. 2. CD56 antigen coexpression on the blast cell population in case of AMKL.

 

Рис. 3. Пример коэкспрессии CD300 на бластных клетках при ОМегЛ.

Fig. 3. The example of CD300 coexpression on the blasts in case of AMKL.

 

Лечение больных осуществлялось по протоколам, представленным в разделе «Материалы и методы». Ремиссия достигнута у 10 (71,4%) из 14 больных.

Уровни МОБ оценивали у 6 больных в различные сроки, в 1 случае – дважды: на 15 и 34-й дни, 26, 42, 50-й дни, 8 мес.

Приводим некоторые примеры определения МОБ у детей с ОМЛ М7 (ОМегЛ).

Больная С. (№3 в табл. 2). Оценка МОБ у данной пациентки впервые проведена после индукционного цикла AIE с Дакогеном на 42-й день от установления диагноза. Морфологически бластные клетки в костном мозге составили 3,8%, пунктат клеточный, уменьшено количество лимфоцитов – 7,6%. Гранулоцитарный росток снижен – 20,2%, отмечена задержка созревания нейтрофилов на уровне миелоцитов. Эритроидный росток значительно раздражен (62,6%), умеренно выражены явления дизэритропоэза. Мегакариоциты в достаточном количестве.

Примененная панель антител при определении МОБ представлена в табл. 3.

 

Таблица 3. Панель моноклональных антител, использованная при диагностике МОБ у пациентки 3

Table 3. The panel of monoclonal antibodies used in the diagnosis of minimal residual disease (MRD) in women 3

Флуорохромы

№ пробы

V450

FITC

PE

APC

APC-H7

1

SYTO-41

CD41

CD19

CD42b

CD9

2

CD45

CD41a+CD61

CD7

  

3

CD45

CD7

CD10

 

CD9

 

 

Клетки с коэкспрессией мегакариоцитарных антигенов CD42b и CD41 составили 2,16% среди миелокариоцитов. Клетки с экспрессией CD41a/CD61 – 3,63%, с учетом слабой экспрессии CD45 содержание этих клеток среди миелокариоцитов составило 1,05%.

Уровень остаточных лейкозных клеток на 42-й день лечения ОМегЛ у данной пациентки ниже, чем число морфологически выявляемых бластов (3,8%), и составил 1,05%. Это соответствует МОБ-позитивному статусу. Таким образом, у ребенка 7 мес с диагнозом ОМегЛ на 42-й день лечения оставались бластные клетки мегакариоцитарного ряда. Следует отметить, что при диагностике лейкоза нами не установлено иммунофенотипических особенностей злокачественных мегакариобластов, поэтому оценка МОБ проводилась на основании определения бластных клеток с мегакариоцитарными антигенами. Единственной иммунофенотипической особенностью можно было бы считать экспрессию на бластных клетках антигена CD9, однако для использования данного антигена в оценке МОБ требуется дальнейшее накопление материала. У пациентки отсутствовала t(1;22), хотя кариотип характеризовался рядом особенностей: 50,XX,+6,+7,+8:der(11)add(p15), +13,del(17)(q24).

Пример определения МОБ у ребенка 1 года и 8 мес (№4 в табл. 2) на 30-й день от постановки диагноза ОМегЛ. Морфологически пунктат костного мозга среднеклеточный, полиморфный. Бластные клетки составляют 2,4%, лимфоциты – 22,4%. В гранулоцитарном ростке отмечается незначительное ускорение созревания нейтрофилов. Выражена моноцитарная реакция (13,6%). Эритроидный росток редуцирован (2,8%). Количество мегакариоцитов снижено.

При определении МОБ использовались следующие маркеры (табл. 4).

 

Таблица 4. Маркеры, использованные при диагностике МОБ у пациента 4

Table 4. Markers used in the diagnosis of MRD in patient 4

Флуорохромы

№ пробы

V500

V450

FITC

PE

PerCP Cy-5

PE-Cy-7

APC

1

CD45

CD9

CD61+42a

CD33

CD34

CD13

CD117

 

При определении МОБ I этапом объединены клетки с коэкспрессией антигенов CD61+42a, CD117, CD34, CD9. Из полученной популяции исключены клетки с экспрессией CD13 и CD33. Итоговое содержание клеток, соответствующих иммунофенотипу таковых при диагностике, составило 0,01%; рис. 4.

 

Рис. 4. Клетки с иммунофенотипом CD61+42a+CD117+CD34+CD9+CD33-CD13- составляют 0,01% от всех зарегистрированных событий.

Fig. 4. Cells with the CD61 + 42a + CD117 + CD34 + CD9 + CD33-CD13- immunophenotype make up 0.01% of all registered events.

 

Рис. 5. Ядросодержащие клетки с экспрессией мегакариоцитарных антигенов CD61+42a+ в осях CD7/CD33.

Fig. 5. Nucleated cells with expression of megacariocytic antigen CD61+42a+ of CD7/CD33.

 

Пример определения МОБ у ребенка 5 мес, №5 в табл. 2. Определение МОБ у данной больной проведено через 50 дней от момента диагностики по окончании индукционного курса AIE с Дакогеном. Морфологически пунктат костного мозга гипоклеточный. Бластные клетки составляют 2,8%, лимфоциты – 24,4%. Гранулоцитарный росток сужен (32,4%). Увеличено количество моноцитов (8,8%). Эритроидный росток раздражен (31,6%), есть явления дизэритропоэза. Мегакариоциты в достаточном количестве.

Окрашены 2 пробы, набор маркеров представлен в табл. 5.

 

Табл. 5. Маркеры, использованные при диагностике МОБ у пациентки 5

Table. 5. Markers used in the diagnosis of MRD in women 5

Флуорохромы

№ пробы

V500

V450

FITC

PE

Cy-5

APC

APC-H7

1

CD45

SYTO 41

CD58

CD19

CD34

CD10

CD38

2

CD45

 

CD61+CD42a

CD19

 

CD33

 

 

Ядросодержащие клетки в анализируемом образце костного мозга составили 96% (SYTO-41+). Отчетливой популяции (CD42a+CD61)-клеток не определялось, соответственно, нет подобных клеток с экспрессией CD33 (маркер присутствовал на мегакариобластах при диагностике). По-видимому, это можно рассматривать как эффективность проведенного лечения и МОБ-негативный статус.

Пример определения МОБ у пациента 7 лет, №6 в табл. 2.

Использованная при диагностике панель моноклональных антител указывала на мегакариобластный вариант острого лейкоза с коэкспрессией антигена CD7: CD33+CD13-CD7+CD(42a+61)+CD41+CD9+CD71+MPO-HLA-DR-CD117-CD42b-.

На 15-й день лечения произведено определение МОБ.

При морфологическом исследовании пунктат костного мозга крайне беден клеточными элементами. Подсчет произведен на 100 клеток. Бластные клетки не найдены; преобладают лимфоциты (94,0%). Умеренно выражена плазмоклеточная реакция (4,0%). Эритроидный росток отсутствует. Мегакариоциты не найдены (уровень лейкоцитов крови – 0,59×109/л; тромбоциты – 8×109/л; гемоглобин – 9,8 г/дл).

При определении МОБ I этапом выделены ядросодержащие синглетные клетки, и в их пределах взяты в гейт клетки с экспрессией мегакариоцитарных антигенов (СD42a+CD61)+ – 0,21% от миелокариоцитов.

Полученный гейт размещен в осях CD7/CD33. На рис. 5 видно, что коэкспрессия CD7 присутствует на 73,8% мегакариоцитарных клеток, в то время как CD33 практически отсутствует. Объединенный гейт (CD42a/CD61)+ CD7+ характеризуется слабой экспрессией CD45 (клетки-предшественники). Эти клетки составили 0,15% от миелокариоцитов. Данный процент клеток мог быть расценен как МОБ у данного пациента.

Повторное определение МОБ проведено на 34-й день лечения. По данным морфологического исследования пунктат костного мозга гипоклеточный. Бластные клетки не найдены, лимфоциты составляют 18,0%. В гранулоцитарном ростке (63,0%) отмечается преобладание зрелых форм (53,2%). Умеренно выражена моноцитарная реакция (13,8%). Содержание клеток эритроидного ростка снижено до 5,2%. Мегакариоциты единичные в препарате. На момент исследования уровень лейкоцитов крови составил 2,57×109/л, тромбоцитов – 72×109/л.

При проточно-цитометрическом определении МОБ в пределах гейта ядросодержащих клеток, исключающего дуплеты, выделены клетки с экспрессией CD42a, их количество составило 0,67%. Четкого кластера CD7+ событий в пределах клеток с экспрессией CD42a не наблюдалось, а в целом коэкспрессия CD7 на этих клетках составила 7,74%. Таким образом, клетки с иммунофенотипом, соответствующим таковому при диагностике лейкоза, – CD42a+CD33+CD13-CD7+ составили 0,02%, что близко к МОБ-негативному статусу.

Еще один пример. Мальчик, 1 год 7 мес, №7 в табл. 2. При диагностике определяется экспрессия миелоидного антигена CD33 при отсутствии CD117 и CD13, а также яркая экспрессия мегакариоцитарных антигенов CD42a, CD61, CD42b, CD41.

Поскольку в этом случае мегакариоцитарные маркеры мономорфно экспрессированы на бластах, оценка МОБ проводилась как при ОМегЛ и включала 2 пробы (табл. 6).

 

Таблица 6. Маркеры оценки МОБ у больного 7

Table 6. Markers used in the diagnosis of MRD in patient 7

Флуорохромы

№ пробы

V450

V500

FITC

PE

PE-Cy5

PE-Cy7

APC

APC-H7

1

HLA-DR

CD45

CD61+CD42a

CD25

CD34

CD117

CD42b

CD9

2

 

CD45

SYTO-16

 

CD34

 

CD42b

 

 

При оценке МОБ последовательно выделены клетки, экспрессировавшие мегакариоцитарные антигены, в пределах клеток-предшественников CD45low с низкими уровнями бокового рассеяния (SSC). При оценке коэкспрессии на этих клетках CD117 и CD34 уровень МОБ составил 0,006%, что по всем международным критериям соответствует МОБ-негативному статусу.

Представленные примеры наглядно иллюстрируют возможности иммунодиагностики и определения уровней МОБ при ОМегЛ у детей.

Обсуждение

Нами приведены примеры диагностики и оценки МОБ при ОМегЛ у детей.

Интересно отметить, что у 3 пациенток младше 1 года в костном мозге присутствовало 2 популяции бластов: одна представлена нормальными В-линейными предшественниками, другая – опухолевыми мегакариобластами. В связи с этим необходимо остановиться подробно на особенностях кроветворения детей младшего возраста. Популяционный состав клеток костного мозга новорожденных и детей в возрасте менее 1 года значительно отличается от костного мозга детей более старшего возраста и взрослых [10]. В табл. 7 представлены возрастные особенности состава клеток костного мозга.

 

Таблица 7. Возрастные особенности состава клеток костного мозга

Table 7. Age-related characteristics of the bone marrow cells

Популяции клеток костного мозга

Процентное содержание клеточных популяций костного мозга в зависимости от возраста

дети до 1 года

дети от 1 до 7 лет

дети старше 7 лет

взрослые до 70 лет

CD34+ миелобласты составляют в среднем

1,4% (от 1 до 2%)

0,9% (0,6–1,6%)

0,6% (0,2–1,1%)

0,7% (0,3 1,3%)

Нейтрофилы

10,7% (6,2–15,0%)

16,7% (6,9–26,4%)

21,4% (12,8–29,4%)

22,8% (12,9–30,8%)

Эритробласты

8,4–10,3%

12,5–15,1%

В-линейные предшественники

15,5% (2,2–32,9%)

9,0% (1,3–22,8%)

2,0% (0,2–4,9%)

0,9% (0,0–2,6%)

Зрелые В-лимфоциты

1,4

2,8

 

Таким образом, в костном мозге детей 1–2-го года жизни присутствуют популяции нормальных бластных клеток, относящихся к В-линейным и миелоидным предшественникам, и популяция В-линейных предшественников широко варьирует от 2,2 до 32,9%. Для точной морфоцитохимической и проточно-цитометрической диагностики острого лейкоза необходимо тщательное разделение бластной популяции на нормальные В-линейные, миелоидные и опухолевые бласты.

Иммунологически опухолевые клетки представлены мегакариобластами, на которых может присутствовать аберрантная коэкспрессия лимфоидных маркеров – чаще всего CD7, могут отсутствовать пан-миелоидные маркеры CD33 и CD13, а также отсутствовать некоторые из мегакариоцитарных маркеров, что также будет являться аберрантностью. Длительное время считалось, что мегакариоциты продуцируются общим бипотентным мегакариоцитарно-эритроидным предшественником (биМЭП). Иммунологически такая клетка в различных исследованиях охарактеризована как Lin−Sca1−cKit+ CD34−FcγRII/IIIlow/- или Lin−Sca1−cKit+CD41−CD150+ Endoglin−FcγRII/III−. Однако существовала гипотеза о том, что мегакариоцитопоэз протекает в обход биМЭП. В недавних исследованиях показано существование отдельной популяции гемопоэтических стволовых клеток, которые являются предшественниками клеток, продуцирующих тромбоциты. В крупных экспериментальных работах по трансплантации единственной клетки-предшественника также показано существование таких мегакариоцитарных предшественников, способных восстановить популяцию мегакариоцитов [17, 18]. Таким образом, в экспериментах получены данные о том, что клетка-предшественник мегакариоцитопоэза находится на более высоком уровне в иерархии гемопоэза, чем считалось прежде. Однако стадии мегакариоцитопоэза от такого предшественника до тромбоцитов все еще охарактеризованы недостаточно.

Для изучения мегакариоцитопоэза необходимо выделение мегакариоцитарных предшественников. Ранее для выделения из компартмента Lin-Sca1-cKit+ предшественников унипотентных мегакариоцитарных предшественников (уМКП) использовались такие маркеры, как CD9, CD41, CD150 в различных комбинациях. Однако ни один из этих маркеров не линейно-специфичный для мегакариоцитарной линии дифференцировки [18–20].

В исследовании H. Nishikii и соавт. [18] показано, что CD42b (гликопротеин Ibα), который считается специфичным мембранным антигеном зрелых мегакариоцитов и тромбоцитов, экспрессируется уМКП внутри компартмента Lin-Sca1-cKit+. Также показано, что CD42b может использоваться для выделения уМКП: от 6 до 7% миелоидных предшественников с иммунофенотипом Lin-Sca1-cKit+CD34+FcγRII/RIIIlow/- в норме экспрессируют CD42b. В то же время CD42b отсутствует на Lin-Sca1+cKit+ (LSK) клетках, на гранулоцитарно-моноцитарных предшественниках (Lin-Sca1-cKit+CD34+ FcγRII/RIII+) и биМЭП. уМКП также имели мембранную экспрессию CD150, CD41high и CD9high, CD42c, CD42d и CD42a. При окраске по Романовскому–Гимзе уМКП имели морфологию одноядерных бластных клеток с базофильной цитоплазмой; морфологически сходство с мегакариоцитами отсутствовало. Через 5 дней культивации уМКП в жидких питательных средах в присутствии стволовоклеточного фактора роста и тромбопоэтина наблюдался рост однородной колонии крупных многоядерных клеток, морфологически сходных со зрелыми мегакариоцитами, позитивных по CD42b. При введении этих клеток мышам, получившим сублетальную дозу облучения, через 4 дня наблюдалось появление тромбоцитов в периферической крови. Также на этих клетках в отсутствие линейно-специфичных маркеров и Sca1 экспрессировались CD9 (ярко), CD150, CD41. Таким образом, сочетание CD42b и CD34 может использоваться для выделения уМКП.

Такой метод может применяться для установления уровня МОБ, так как количество клеток с иммунофенотипом Lin-cKit+(CD117+)CD34+CD42b+ в костном мозге здорового донора не превышает 0,1% [21–23]. В то же время остается необходимость в подсчете клеток с таким иммунофенотипом в регенерирующем после цитостатического воздействия костном мозге, так как данные о таком подсчете в мировой литературе единичны. Кроме того, при выделении клеток с иммунофенотипом Lin-cKit+(CD117+)CD34+CD42b+ при определении МОБ важно дополнительно определять клетки с аберрантным иммунофенотипом, соответствующим таковому при диагностике, например, клетки CD117+CD34+ CD42b+CD7+, CD117+CD34+CD42b+CD41- и CD117-CD34-CD42b+CD9+.

Таким образом, выявление остаточных опухолевых клеток в ремиссии ОМегЛ принципиально отличается от выявления МОБ при других вариантах ОМЛ благодаря специфичному иммунофенотипу и низкому содержанию мегакариобластов в здоровом костном мозге. В целом можно отметить, что ОМегЛ является морфологически гетерогенным заболеванием, и оценка ряда новых подходов, в частности компьютерного моделирования с использованием экспертных систем искусственного интеллекта, основанных на морфологических и иммунологических признаках клеток, может способствовать дальнейшему уточнению критериев диагностики МОБ.

Заключение

При определении МОБ между курсами ХТ необходимо учитывать аберрантность опухолевых клеток при первичной диагностике, так как количество клеток с экспрессией мегакариоцитарных антигенов и мегакариоцитарных предшественников может быть увеличено по сравнению с нормой в связи с постцитостатической регенерацией костного мозга. Требуется использование нуклеотропных красителей для достоверного отделения ядросодержащих клеток с экспрессией мегакариоцитарных антигенов от тромбоцитов. Также необходима широкая панель антигенов как при диагностике – для выявления опухолеассоциированного аберрантного иммунофенотипа, так и при определении МОБ – для выделения клеток с истинной экспрессией мегакариоцитарных антигенов от миелоидных предшественников с агрегацией на них тромбоцитов. Построение унифицированных алгоритмов определения МОБ при ОМегЛ требует дальнейшего набора материала ввиду редкости заболевания и является перспективным, учитывая низкий процент мегакариобластов в норме.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ №18-29-09115.

Financing. The work was carried out with the financial support of the RFBR grant No. 18-29-09115.

About the authors

Alexandra D. Palladina

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: palladinaa@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9400-7347

Russian Federation, Moscow

doctor, Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Aleksandr V. Popa

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: apopa@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-5318-8033

Russian Federation, Moscow

D. Sci. (Med.), Prof. RAS

Timur T. Valiev

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: timurvaliev@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1469-2365

Russian Federation, Moscow

D. Sci. (Med.)

Valentin G. Nikitaev

National Research Nuclear University MEPhI

Email: kaf46@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4349-3023

Russian Federation, Moscow

D. Sci. (Techn.)

Olga A. Chernysheva

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: beznos.olga@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9630-5591

Russian Federation, Moscow

Cand. Sci. (Med.)

Natalia A. Kupryshina

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: 2511@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8509-0954

Russian Federation, Moscow

Cand. Sci. (Med.)

Irina N. Serebryakova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: palladinaa@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8389-4737

Russian Federation, Moscow

Cand. Sci. (Med.)

Tamara V. Shvedova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: palladinaa@gmail.com

Russian Federation, Moscow

biologist

Konstantin L. Kondratchik

Pirogov Russian National Research Medical University; Morozov Children’s Clinical Hospital

Email: morozov-14@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5195-4539

Russian Federation, Moscow; Moscow

Cand. Sci. (Med.)

Nikolai N. Tupitsyn

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: nntca@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0003-3966-128X

Russian Federation, Moscow

D. Sci. (Med.)

References

  1. Von Boros J, Korenyi A. Uber einen fall von akuter megakaryocyblasten-leukamie, zugleich einige bemerkungen zum. Problem der akuten leukemie. Z Klin Med 1931; 118: 679–718.
  2. Hahn AW, et al. Acute megakaryocytic leukemia: What have we learned. Blood Rev 2015. doi: 10.1016/j.blre.2015.07.005
  3. Breton-Gorius J, Reyes F, Duhamel G, et al. Megakaryoblastic acute leukemia: identification by the ultrastructural demonstration of platelet peroxidase. Blood 1978; 51: 45–60.
  4. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Criteria for the diagnosis of acute leukemia of megakaryocyte lineage (M7), a report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Intern Med 1985; 103: 460–2.
  5. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues (Revised 4th edition). Eds. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. IARC: Lyon, 2017; p. 163.
  6. Луговская С.А., Почтарь М.Е. Гематологический атлас. 4-е изд. М.–Тверь: Триада, 2016 [Lugovskaya SA, Postman ME. Hematological atlas. 4th ed. Moscow–Tver: Triada, 2016 (in Russian)].
  7. Окороков А. Диагностика болезней внутренних органов. Кн. 5-1. М.: Мед. лит-ра, 2019; с. 700 [Okorokov A. Diagnosis of diseases of internal organs. Book. 5-1. Moscow: Med. liter, 2019; p. 700 (in Russian)].
  8. Masettia R, Guidia V, Ronchinia L, et al. The changing scenario of non-Down syndrome acute megakaryoblastic leukemia in children. Crit Rev Oncol Hematol 2019; 138: 132–8.
  9. De Marchi F, Araki M, Komatsu N. Molecular features, prognosis, and novel treatment options for pediatric acute megakaryoblastic leukemia. Expert Rev Hematol 2019. doi: 10.1080/17474086.2019.1609351
  10. Pont J, Souvignet A, Campos L, et al. Accurate Quantification of Fourteen Normal Bone Marrow Cell Subsets in Infants to the Elderly by Flow Cytometry. Cytometry B Clin Cytom 2018; 94 (5): 627–36.
  11. Carroll A, Civin C, Schneider N, et al. The t(1;22) (p13;q13) is nonrandom and restricted to infants with acute megakaryoblastic leukemia: a Pediatric Oncology Group Study. Blood 1991; 78 (3): 748–52.
  12. Mercher T, Busson-Le Coniat M, Nguyen Khac F, et al. Recurrence of OTT-MAL fusion in t(1;22) of infant AML-M7. Genes Chromosomes Cancer 2002; 33: 22–8.
  13. Inaba H, Zhou Y, Abla O, et al. Heterogeneous cytogenetic subgroups and outcomes in childhood acute megakaryoblastic leukemia: a retrospective international study. Blood 2015; 126 (13): 1575–84.
  14. O’Brien MM, Cao X, Pounds S, et al. Prognostic features in acute megakaryoblastic leukemia in children without Down syndrome: a report from the AML02 multicenter trial and the Children’s Oncology Group study POG 9421. Leukemia 2015; 344 (6188): 1173–8.
  15. Giri S, Pathak R, Prouet P, et al. Acute megakaryocytic leukemia is associated with worse outcomes than other types of acute myeloid leukemia. Blood 2014; 124 (25): 3833–4
  16. van Dongen JJ, Lhermitte L, Böttcher S, et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia 2012; 26 (9): 1908–75. doi: 10.1038/leu.2012.120; PMID: 22552007
  17. Miyawaki K, Iwasaki H, Jiromaru T, et al. Identification of unipotent megakaryocyte progenitors in human hematopoiesis. Blood 2017; 129 (25): 3332–43. doi: 10.1182/blood-2016-09-741611; PMID: 28336526
  18. Nishikii H, Kanazawa Y, Umemoto T, et al. Unipotent Megakaryopoietic Pathway Bridging Hematopoietic Stem Cells and Mature Megakaryocytes. Stem Cells 2015; 33 (7): 2196–207. doi: 10.1002/stem.1985
  19. Ferkowicz MJ, Starr M, Xie X, et al. CD41 expression defines the onset of primitive and definitive hematopoiesis in the murine embryo. Development 2003; 130: 4393–403; PubMed: 12900455
  20. Deutsch VR, Tomer A. Advances in megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis: From bench to bedside. Br J Haematol 2013; 161: 778–93; PubMed: 23594368
  21. Björklund E, Gruber A, Mazur J, et al. CD34+ cell subpopulations detected by 8-color flow cytometry in bone marrow and in peripheral blood stem cell collections: application for MRD detection in leukemia patients. Int J Hematol 2009; 90 (3): 292–302. doi: 10.1007/s12185-009-0389-z; PMID: 19728029
  22. Wen Q, Goldenson B, Crispino JD. Normal and malignant megakaryopoiesis. Expert Rev Mol Med 2011; 13: e32. doi: 10.1017/S1462399411002043; PMID: 22018018; PMCID: PMC4869998
  23. Macedo A, Orfao A, Ciudad J, et al. Phenotypic analysis of CD34 subpopulations in normal human bone marrow and its application for the detection of minimal residual disease. Leukemia 1995; 9 (11): 1896–901. PMID: 7475281.

Supplementary files

Supplementary Files Action
1.
Fig. 1. CD7 coexpression on the blast cell population in case of acute megakaryoblastic leukemia (AMKL).

Download (23KB) Indexing metadata
2.
Fig. 2. CD56 antigen coexpression on the blast cell population in case of AMKL.

Download (11KB) Indexing metadata
3.
Fig. 3. The example of CD300 coexpression on the blasts in case of AMKL.

Download (15KB) Indexing metadata
4.
Fig. 4. Cells with the CD61 + 42a + CD117 + CD34 + CD9 + CD33-CD13- immunophenotype make up 0.01% of all registered events.

Download (22KB) Indexing metadata
5.
Fig. 5. Nucleated cells with expression of megacariocytic antigen CD61+42a+ of CD7/CD33.

Download (14KB) Indexing metadata

Statistics

Views

Abstract - 54

PDF (Russian) - 31

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.


Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies