Immunoliposomy - novoe sredstvo dostavki lekarstvennykh preparatov

Abstract

В конце XIX века немецкий бактериолог Пауль Эрлих предложил термин "волшебная пуля", подразумевающий химиопрепарат, который находит в организме и избирательно убивает опухолевые клетки без повреждения окружающих здоровых тканей. С тех пор селективный транспорт химиотерапевтических препаратов к опухоли in situ остается предметом многочисленных исследований. Одним из способов достижения этой цели является разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевых препаратов.Оригинальным направлением в липосомологии явилась разработка нового поколения лекарственных препаратов - иммунолипосом.К настоящему времени описано несколько препаратов иммунолипосом, потенциально перспективных для применения в онкологической практике.Кроме того, иммунолипосомы стали применять для создания иммуномагнетиков с целью фракционирования CD34-положительных стволовых клеток человека, для создания иммунодиагностикумов.

Full Text

В конц е XIX века немецки й бактериолог Пауль Э рлих предло жи л тер ми н "волш ебная пуля", подразумевающ и й хи мио - препарат , котор ы й находит в организме и избирательно убивает опухолевы е клетки без повреждения окру ж ающ и х здоровы х тканей. С тех по р селективн ы й тра нспор т хи мио терапев - тических препаратов к опухол и in situ остается предметом мно гочисле нны х исследований. О дни м и з способо в достижени я это й цел и является разработка липосо м ально й лекарственно й ф орм ы противоопухолев ых препаратов . Липо со м ы представляю т собо й закр ы ты е с ф ерические пузырьки, образова нны е и з ф ос ф олипидов , котор ы е состоят и з гидро фильно й головки и гидро ф обног о хвоста. В ходе образования ли- посо м гидро фи льн ы е вещ ества об ы чн о попадаю т в срединно е водно е пространств о пузырьков , а липо фи льн ы е субстанции встраиваю тся в ф ос ф олипидн ы й слой. Липо со м ы вперв ы е описан ы окол о 30 лет назад и на зва н ы ф ос ф олипидн ым и с ф е - рулами. Вначале липосо м ы использовалис ь как модельна я система пр и изучении биологических м ембран, а затем - как средство доставки лекарственн ы х препаратов , в то м числ е и противоопухолевых . П оследующ ие исследования в это м направлении привел и к созданию больш ог о количеств а липосо - м альн ы х ф орм , способн ы х нест и ш ироки й спект р препаратов, неко тор ы е и з ни х уже на ш л и клиническо е применение . Липо со м ы сущ ественн ы м образо м улучш или терапевтическую э фф ективност ь противоопухолев ых препаратов и снизил и токсич нос т ь п о сравнени ю с о свободн ым и субстанция м и [1, 2]. О днак о не все цитостатики пригодны для создания липо - со м альн ы х лекарственн ы х ф орм . Так, пр и вкл ю чени и метот- рексат а и цитозар а в липосо м ы их токсич нос т ь возрастает , тогда как пр и вкл ю чени и доксорубицина - снижается. Н едостатком липосо м альн ы х ф ор м является и х бы страя оп- сонизаци я пр и внутривенно м введении и последующ и й захват клетками ретикулоэндотелиальной систе м ы (РЭС). Для преодоления захвата липосо м мононуклеара м и РЭС учен ы е разработал и липосо мы - невидимки . С это й цель ю в липидн ы й сло й липосо м встраиваю т полиэтиленгликол ь (ПЭГ), чт о приводит к повы ш ени ю осмотическог о давления вокруг липосо м и препятствуе т их сбли ж ени ю с клеткой. Эти везикулы называю тся пегилированными липосо м а ми , он и являю тся невидимым и для клеток РЭС и долгое врем я циркулирую т в крови. О днак о пегилированные липосо м ы име ю т сущ ественн ы й недостаток - он и также плох о накапливаю тся в опухоли. О ригинальн ы м направление м в липосо мо логи и явилас ь разработка ново г о поколени я лекарственн ы х препаратов - иммунолипосом. И мм унолипосо м ы представляю т собо й липосомы, к котор ы м прикреплены моноклональн ы е антитела (МКА). МКА обеспечиваю т специ фи ческо е связы вание липосом с антигенпозитивн ым и клетками, а липосо м ы несут соответствующ ий гидро ф обн ы й ил и гидро фи льн ы й хи мио тера - певтический препарат . В настоя щ е е врем я различаю т тр и типа иммунолипосом: А, В и С [3]. В иммунолипосома х тип а А МКА ковалентно связаны с об ы чн ым и липосо м а м и посредством коротког о якоря. Тип В - эт о уже пегилированные липосо мы , в котор ы х МКА также ковалентно связаны с ним и посредством коротког о якоря . Тип С ( Pendant-type PE G - imm unoliposom es) - эт о стерически стабилизированн ы е ПЭГ липосо мы , в котор ы х МКА прикреплены к дистальном у тер мин ально м у конц у ПЭГ. С помо щ ь ю липосо м типа А бы ло убедительно продемонст рировано , чт о иммунолипосомы боле е э фф ективн о доставляют лекарства в клетки-миш ени по сравнени ю с об ы чн ым и липосомами в тестах как in vitro, так и in vivo [4]. О днак о связывани е иммунолипосо м с клетками-миш еня м и in vivo б ы л о более сложным . И зуче ние иммунолипосо м in vivo показало, чт о прикрепление к липосо м а м антител усиливало их захват мононуклеарами РЭС. Эфф ективност ь связы вания иммунолипосо м с клетками-миш еня м и зависела от плотност и антите л на поверхност и липосо м . Захват иммунолипосо м клетками РЭС и эндотелиальн ы й барьер, разделяющ и й сосудистое русло от опухолевой ткани, побудил и исследователе й к созданию нового типа липосо м . Это привел о к конструированию стерически стабилизированн ы х иммунолипосом, с удлиненн ы м периодо м циркуляции в крови. В первых работа х по созданию долгоциркулиру юш и х иммунолипосо м к стерически стабилизированн ы м липосо м а м , содер ж а щ и м ф ос ф олипид ы с мо ди фици рованн ым и ПЭГ головн ым и группа ми, антитела бы ли прикреплены чере з коротки й гидро фи льн ы й якор ь близко к поверхност и липосо м (липосомы типа В) [5]. Эти липосо м ы сохранял и свойств о долговрем енно й циркуляции, но взаимо действие с клетками-мишенями бы ло угнетено по то м у же механизму, как и угнетение захвата мононуклеара м и РЭС, т.е. из-за блокады ПЭГ [6]. П озж е МКА бы ли прикреплены к дистальн ы м конца м цепе й ПЭГ, связанн ы м с липосо м а м и (л ипосомы типа С). Это привело к сохранени ю способност и стерически стабилизированны х липосо м специ фи ческ и связываться с клеточно й поверхнос ть ю клеток-миш ене й и быть за щ и щ енн ым и от захвата мононуклеарами РЭС [7]. С равнение э фф ективност и специ фи ческог о связы вания и захвата мононуклеара м и РЭС эти х тре х типо в иммунолипо сом, проведенно е К М а ш уат а [3] на модели МКА 34А проти в поверхностног о эпителия легких, показало, чт о 42 ,5 % липосом типа А накапливаю тся в легких, а в кров и и печен и выявляется небольш о е количество. П р и введении липосо м типа С специ фи ческ и связываю тся 56,6% от введенной доз ы липосо м . В кров и и печени накапливалос ь м ень ш е препарат а (7%), че м пр и инъекци и липосо м типа А. Липо со м ы типа В показали ни зки й уровень специ фи ческог о связы вания и окол о 60 % препарат а от введенной доз ы долг о циркулировал о в крови. Таким образом, наиболе е перспективными явля ю тс я липосо м ы типа С. В настоя щ е е врем я для ковалентног о прикреплени я МКА к тер мин альн ы м конца м ПЭГ, с цель ю получения стабильной связи антите л с ПЭГ, использую т тр и метода, т.е. связы вание чере з серу (th io ther) [7], ами дн ы е группировк и (am ide) [3] и ги- дразоны ( h idraz one ) [8]. К антителам, используемым в конструировании иммунолипосом, предъявляю т определенн ы е требова ния . МКА дол жн ы сохранит ь свою специ фи чност ь пр и конъ ю гаци и с липосомами, имет ь а финность , достаточну ю для связы вания ни зко й концентраци и иммунолипосом, обладат ь ни зко й иммуноген- ностью . С это й цель ю использую т гу м анизированн ы е МКА, для удаления мышино г о белка, а также Fab' ф рагмент ы антите л для удаления ф рагменто в Fe. Антитела дол жн ы э фф ективн о ин - тер нализов ы ваться клетками-ми ш еня м и путем эндоцитоза , обладат ь биологической активность ю и усиливат ь противо опухолевы й ответ. МКА дол жн ы бы ть тех ноло гич н ы в произ водстве и имет ь достаточн ы й сро к хранени я [9]. К антигену, являющ ем уся миш ень ю для иммунолипосом, также име ю тся определенн ы е требова ния . О н дол ж ен сильно и го мо ге нн о экспрессироватьс я в опухолевой ткани, бы ть жи з ненн о важным для опухолевой клетки и не исчезат ь с клеточ но й поверхности. Антиген дол ж е н миним альн о слущи- ваться с поверхност и опухолевой клетки для избежания связ ы вани я иммунолипосо м с растворим ы м антигеном ил и усилени я клиренса . К омплекс антиген-и мм унолипосо м а дол ж е н пиницитироватьс я в опухолевую клетку. Связь антите л с липосо м а м и дол жн а бы ть стабильной в крови. Я корь не дол ж е н связываться с распозна ющ и м м естом на молекуле антите л и бы ть иммуногенен, дол ж е н быть нетоксиче н и избегат ь опсонизации, не дол ж ен влият ь на препара т в липосо м е , стабильност ь липосо мно й м е мбр ан ы и оказы вать стерическое препятствие . Эфф ективно е связы вание иммунолипосо м с клетками-миш еня м и происходит ли ш ь тогда, когда миш ен и находятся в сосудистом пространств е ил и когда иммунолипосомы проходя т сквоз ь слабую сосудистую стенку. В литературе рассматрива ю тся два анато мич ески х подхода. П ерв ы й - эт о уже существующ и е внутрисосудист ы е места, такие как поверхностный эндотелий сосудов, клетки кров и ил и тро мбы . В торой - м ене е доступн ы е места, такие как солидн ы е опухоли, места инфекци и ил и воспаления, в котор ы х сосудистые структуры слабы [3]. Д оказано, чт о капиллярна я проницаемост ь эндотелиаль - но г о барьера во внов ь васкулиризируе мы х опухолях значитель н о выше, че м в нормальных тканях. Н ормальн ы е тка н и вы стланы нефенес трирова нны м сосудистым эндотелие м , и прохождени е м акро молекул ил и липосо м в тка н ь затруд нено. К роме того, в опухолевой тка н и практически отсутствует дренировани е ли мф атическо й системой , поэтому макромолекулы и липосо м ы накапливаю тся в опухолевой тка н и и остаю тся там длительное время. Н ескольки м и м етода м и в различн ы х опухолевы х моделях н а мыш а х бы ло убедительно доказано, чт о липосо м ы диа м етро м 100 -20 0 н м проходя т чере з сосудистую стенку и накапливаю тся в опухолевой ткани. Больш о е з начени е имее т соотно ш ени е антите л к липида м в иммунолипосоме . Так, пр и весовом соотно ш ени и 1:50 к одно й липосо м е присоединялос ь 24 молекулы моноклональн ы х антител, а пр и соотно ш ени и 1:1 - 93 5 молекул антител. Специфи ческо е накоплени е иммунолипосом, конструированн ы х пр и соотно ш ени и 1:50, бы ло Ъ% от введенной дозы, а созданны х пр и соотно ш ени и компоненто в 1:1 - 60 % от введенной доз ы иммунолипосом. Захват иммунолипосо м клетками печени сни ж ался с 50% от введенной доз ы для липосо м с ни зки м содер ж ание м антите л до 12% для липосо м с в ы соким содержание м антител. П р и это м захват иммунолипосом, содер ж а щ и х ни зко е количеств о антител, н е отличалс я о т захвата об ы чн ы х липосо м . И мм унолипосо мы , котор ы е не связались с клетками- миш еня м и пр и первых нескольких пассажа х чере з опухолевые капилляры , накапливалис ь в печен и и селезенке [3]. С пецифическа я доставка противоопухолев ых препаратов с помо щ ь ю иммунолипосо м способствовала лучш ей терапевтическо й э фф ективност и и сни ж ени ю токсич нос т и по сравнени ю с об ы чн ым и липосо м а м и [1]. Это б ы л о убедительно проде мон стрировано на моделях солидн ы х опухоле й у мыш е й [10] на ксенотрансплантата х человеческой В-клеточ ной ли м - ф ом ы у гол ы х мыш е й [8]. К нас тоя щ е м у вре м ен и описан о нескольк о препарато в имм унолипосо м , потенциально перспективных для примене ни я в онкологическо й практике . Он и направлены проти в клеток, экспрессиру ющ и х антигены CD 71 ( рецепто р тра нс - ф еррина) , H er2/ne u ( рецепто р эпидер м альног о ф актор а роста ) [11], HLA-DR (а н тиге н ы гистосов м ести мо ст и II класса) [12, 13], CD1 9 ( об щ е- В -клеточ ны й м аркер ) [8], LL2 (а н тиге н В -клеточ но й ли мфомы ) [14] и др. К роме того, иммунолипосомы стали применят ь для создани я иммуномагнетико в с цель ю ф ракционировани я CD 34-no- ло жи тель ны х стволовы х клеток человека [15], для создания иммунодиагностикумо в [ 16] и т.д. Таким образом, иммунолипосомы могут воплотит ь иде ю Пауля Э рлих а о "в ол ш ебно й пуле", избирательно находить и убиват ь опухолевую клетку, не поврежда я окру ж ающ и е тка н и и не оказы вая токсическог о действия на организ м больного. Н о следует учесть, чт о иммунолипосомы - эт о технологически очен ь сложн ая систем а доставки лекарственн ы х препаратов, завися щ ая от мно ги х составля ющ и х ее компонентов . Однак о бурно е развитие биотехнологии вселяет надежду на то, чт о иммунолипосомы дойдут д о клиники.