The characteristics of determination of BRCA1 and BRCA2 mutations in serous ovarian cancer

Full Text

Рис. 1. Репаративный механизм, участниками которого являются BRCA1 и BRCA2 (по A.Meindl, 2011). Рис. 2. PARP-ингибирование и синтетическая летальность (по J.Lee и соавт., 2014). Рис. 3. Влияние сочетания факторов риска (семейный анамнез, личный анамнез, национальность) на процент потерь в выявлении возможных носительниц герминальных мутаций при РЯ (по D.Eccles и соавт., 2016). Вступление Опухолевые супрессоры BRCA1 и BRCA2 играют ключевую роль в поддержании генетической стабильности клетки, являясь основными участниками механизма наиболее точного восстановления разрывов двухцепочечной ДНК - так называемой репарации путем гомологичной рекомбинации [1, 2]. Краткая схема, иллюстрирующая работу этого механизма, представлена на рис. 1. Потеря функции BRCA1/BRCA2 может возникнуть как в результате наследственно обусловленных (герминальных) мутаций, так и при возникновении соматических аберраций или эпигенетической блокады нормальной регуляции генов непосредственно в опухоли. В этом случае восстановление поврежденной ДНК происходит с участием менее точных механизмов, что ведет к нарастанию генетической нестабильности и злокачественной трансформации клеток. Носительство наследственных мутаций ведет к значительному росту риска развития рака яичников (РЯ) - так, герминальные мутации в гене BRCA1 повышают риск до 40-50% в течение жизни, в гене BRCA2 - до 20-25% [3]. По результатам наиболее значительных зарубежных исследований наследственные мутации встречаются примерно в 14% немуцинозного РЯ, в том числе в 17 РЯ высокой степени злокачественности. Около 6% пациенток имеют соматические мутации BRCA1/BRCA2, определяющиеся только в опухоли [4, 5]. Следует особо отметить, что, по данным приведенных исследований, 44% носительниц герминальных мутаций не имели прослеженного наследственного анамнеза. Определение мутаций генов BRCA1/BRCA2 у больных РЯ Необходимость определения мутаций генов BRCA1/BRCA2 у больных РЯ диктуется в первую очередь биологическими особенностями подобных опухолей, отличающихся крайне высокой чувствительностью к препаратам платины и существенно лучшим прогнозом по сравнению с РЯ. Эта чувствительность обусловлена упомянутыми выше дефектами репарации ДНК после воздействия производных платины [6]. Кроме того, появление новых препаратов, блокирующих другие пути репарации, таких как ингибиторы поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), и показавших особую эффективность именно в лечении больных РЯ с мутациями генов BRCA1/BRCA2, дало новое клиническое значение определению этих мутаций в рутинной практике. Белки семейства PARP участвуют в процессе восстановления одноцепочечных разрывов ДНК, механизме, значение которого возрастает в условиях нарушения работы другого важнейшего механизма восстановления - ДНК-восстановления двухцепочечных разрывов, что обычно бывает при мутациях генов BRCA1/BRCA2. Поэтому ингибирование белков PARP в клетках, несущих эти мутации, приводит к феномену так называемой синтетической летальности, приводящему к необратимому повреждению ДНК (рис. 2) [7]. В проведенных рандомизированных исследованиях было продемонстрировано статистически значимое увеличение выживаемости без прогрессирования (ВБП) для пациенток c платиночувствительным рецидивом РЯ и мутациями BRCA1/BRCA2, получавших PARP-ингибитор олапариб в качестве поддерживающей терапии после полного или частичного ответа на химиотерапию платиносодержащими режимами. Так, у больных, получавших олапариб в качестве поддерживающей терапии в исследовании II фазы (Исследование 19), ВБП увеличилась до 11,2 мес по сравнению с 4,3 мес у пациенток, получавших плацебо, риск прогрессирования снизился на 82% [8]. Современные рекомендации по определению мутаций BRCA1/2 у больных РЯ - мировой опыт и отечественные разработки Еще недавно считалось, что в российской популяции практически исключительно встречаются так называемые фаундерные мутации BRCA1, или «мутации основателя». Сущность эффекта основателя заключается в том, что внутри популяции циркулирует ограниченное количество генетических нарушений, передающихся по наследству, причиной чему является определенная закрытость этноса и относительная редкость смешанных браков. Так, в России, как и в большинстве стран с преимущественно славянским населением, наиболее распространена герминальная мутация BRCA1 5382insC, встречающаяся приблизительно у 0,1% жителей и выявляющаяся почти в 70% случаев наследственного рака молочной железы (РМЖ) и РЯ [10]. Однако последние отечественные исследования выявили не только значимые различия в структуре мутаций между РМЖ и РЯ, но и подтвердили существенно меньшее значение наследственного анамнеза для последней группы пациенток [11]. Более того, значительное этническое разнообразие российского населения сделало необходимым пересмотр традиционных для нашей страны подходов в определении мутаций BRCA1/2 у больных РЯ. Следует отметить, что до 2013 г. практически все международные рекомендации по тестированию мутаций BRCA1/BRCA2 у больных РЯ предусматривали проведение исследования лишь у пациентов с какими-либо признаками наследственной предрасположенности к заболеванию [12-14]. Как правило, рекомендовалось определение мутаций у пациенток с семейным или личным анамнезом, предполагающим наличие РМЖ или РЯ у ближайших родственников, синхронный/метахронный РМЖ у самой пациентки, ранний возраст манифестации заболевания или принадлежность к этнической популяции с известной высокой частотой герминальных «мутаций основателя» (например, к евреям-ашкеназам или коренному населению Исландии). Однако исследования последних лет показали дефекты подобного подхода к больным серозным РЯ. Оказалось, что сужение тестируемой группы приводит к значительному снижению частоты определения носительниц мутаций BRCA1/BRCA2. Так, по данным D.Eccles и соавт., только 56,3% носительниц имели прослеженный наследственный анамнез, 27,8% - личный анамнез предшествующего РМЖ и лишь у 28,6% пациенток РЯ был диагностирован до 60 лет [15]. Похожие результаты были получены Е.Суспицыным и соавт. при поиске фаундерных мутаций у 354 больных РЯ из двух регионов России. Мутации были обнаружены у 33 пациенток из 266 без семейного анамнеза (12,4% случаев) [11]. Более того, часто используемое сочетание факторов риска приводит к тому, что более 40% случаев носительства может быть пропущено [15] (рис. 3). В связи с этим в последние годы начался пересмотр клинических рекомендаций. Так, последние рекомендации Национальной сети многопрофильных онкологических учреждений США, рекомендации Американского общества онкогинекологии, Шотландские междисциплинарные рекомендации были изменены - тестирование рекомендовано во всех случаях немуцинозного инвазивного РЯ, первичного рака брюшины и маточных труб [16-18]. Такие же изменения были внесены в рекомендации Российского общества клинической онкологии в 2016 г. - генетическое консультирование и определение мутаций BRCA1/BRCA2 предполагается всем больным с серозными и эндометриоидными карциномами высокой степени злокачественности [19]. Особенности тестирования смешанной российской популяции больных РЯ и первые результаты программы Cancergenome.ru Принципиально методы тестирования мутаций BRCA1 и BRCA2 могут быть разделены на две группы. Первая представляет собой секвенирование определенных зон интереса (задействованных экзонов при «эффекте основателя», характерном в том числе для славянских и близких к ним этносов), либо аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на наиболее распространенные мутации. Эти методы способны выявлять короткие делеции/инсерции (indels) и однонуклеотидные замены, представляющие собой практически весь известный спектр мутаций в славянской популяции Российской Федерации. Метод аллель-специфической ПЦР относительно прост, дешев и может выполняться практически в любой лаборатории, персонал которой имеет навыки ее проведения. Ко второй группе можно отнести методы, позволяющие изучить всю кодирующую последовательность обоих генов и обнаружить редкие и уникальные мутации, которые не могут быть выявлены с помощью ПЦР. Конечно, эти методы существенно сложнее, дороже и требуют привлечения серьезных материальных ресурсов и высококвалифицированного персонала. К ним относятся классическое секвенирование по Сэнгеру и метод секвенирования следующего поколения. Метод секвенирования следующего поколения, показавший свою исключительную эффективность в изучении полного спектра возможных генетических аберраций, в настоящее время проходит клиническую валидацию. Учитывая преимущества этого метода и постоянно снижающиеся цены на расходные материалы, следует ожидать его широкого внедрения в практику в ближайшее время. Применение его становится весьма актуальным с учетом высокой частоты носительства мутаций BRCA1/BRCA2 у больных РЯ, особенно принимая во внимание тот факт, что существенная часть этих мутаций может быть уникальной и недоступной для исследования методами, направленными на изучение фаундерных мутаций. Конечно, не последнюю роль в рациональности такого подхода имеет появление дополнительной эффективной терапевтической опции для этих пациенток - возможности терапии ингибиторами PARP. Определенную сложность в трактовке полученных результатов представляют так называемые варианты неясного клинического значения - генетические события, не ведущие к безусловной потере функции протеина или недостаточно охарактеризованные в существующих базах данных ввиду их редкости. Кроме того, существует еще один особый тип мутаций BRCA1/BRCA2 - так называемые длинные делеции, затрагивающие один или несколько экзонов этих генов, не определяемые ни одним из методов, основанных на секвенировании или аллель-специфической ПЦР. Для выявления мутаций такого типа требуется применение метода мультиплексной лигаза-зависимой амплификации зонда (MPLA), однако для российской популяции частота этих мутаций к настоящему моменту не описана. Все больший интерес вызывают так называемые соматические мутации BRCA1/BRCA2, т.е. те, которые определяются исключительно в опухолевых клетках и возникают de novo в процессе онкогенеза. Их значение идентично значению герминальных мутаций, хотя частота встречаемости существенно ниже. Так, в исследовании K.Pennington и соавт. частота соматических мутаций составила 6,8%, а A.Mafficini и соавт. - около 6,2% [7, 20]. По данным, опубликованным группой The Cancer Genome Atlas Research Network (TCGA), соматические мутации выявлялись в 20,4% случаев из всех обнаруженных мутаций BRCA1/BRCA2 или в 4,2% от всей изученной популяции пациенток с РЯ, причем в трех случаях обнаруживалось сочетание герминальных и соматических мутаций [21]. Эти данные убедительно свидетельствуют в пользу исследования образцов опухоли, что позволяет определить наличие не только наследственных генетических нарушений, но и приобретенных в результате неопластической трансформации. В связи с этим эффективно работающая в РФ Программа Российского общества клинической онкологии, направленная на совершенствование молекулярно-генетической диагностики в РФ с целью повышения эффективности противоопухолевого лечения (www.cancergenome.ru), включила в число необходимых генетических исследований определение мутаций генов BRCA1/BRCA2 при платиночувствительном рецидиве РЯ [22]. В настоящее время в Программе по тестированию BRCA1/BRCA2 участвуют 19 лабораторий в различных городах РФ. Программа предусматривает направление на исследование материала больных РЯ, маточных труб и первичным раком брюшины высокой степени злокачественности с платиночувствительным рецидивом заболевания, возникшим не ранее чем через 6 мес после окончания платиносодержащей терапии. На I этапе проводится определение методом ПЦР восьми герминальных мутаций, встречающихся в российской славянской популяции больных РЯ с частотой более 1%. Для выявления мутаций в генах BRCA1/BRCA2 в лабораторию может быть направлен любой материал - как кровь пациентки, взятая с учетом правил, оговоренных на сайте программы, так и парафиновые блоки удаленной опухоли или биопсированного метастаза. Оптимально одномоментно отправлять образец нормальной ткани (кровь/блок) и образец опухолевой ткани (блок). Следующий этап предусматривает проведение секвенирования следующего поколения для тех пациенток, у которых мутации не были обнаружены, несмотря на наличие семейного или личного анамнеза (РМЖ/РЯ у близких родственников по одной линии или синхронный/метахронный РМЖ и РЯ у самой больной). Кроме того, секвенирование следующего поколения обязательно проводится пациенткам, не принадлежащим к славянской этнической группе. Секвенирование следующего поколения позволяет также выявить соматические мутации в образцах опухолевой ткани. С мая 2016 по январь 2017 г. было исследовано 1385 образцов пациенток с платиночувствительным рецидивом РЯ из всех субъектов РФ. В 787 случаях для анализа присылалась кровь больных, в 598 случаях исследовались парафиновые блоки. Большинство пациенток (1049) принадлежали к славянской этнической группе, 330 больных идентифицировали себя как относящихся к 32 минорным этническим популяциям. После I этапа тестирования (ПЦР) герминальные фаундерные мутации были обнаружены у 16,6% пациенток из славянской группы и у 11,8% - из других этнических групп. При этом самая частая славянская мутация 5382insC обнаруживалась у 11,4% славянок и у 6% больных других национальностей. К сожалению, каждая неславянская этническая группа оказалась слишком мала, чтобы полученные результаты могли быть экстраполированы на весь этнос в целом, кроме того, самоидентификация пациенток и сбор информации о национальной принадлежности в первом поколении может не совсем верно отражать истинную родословную больных. Возможно, после накопления большего объема информации удастся достоверно определить частоту «мутаций основателя» в каждой из национальных групп. На II этапе проводилось исследование образцов пациенток с наследственным/личным анамнезом и пациенток из неславянских этнических групп, в которых не были обнаружены мутации при первичном обследовании, с помощью метода секвенирования следующего поколения. Дополнительно было выявлено 47 мутаций с частотой от 0,03% до 2,3%. Наиболее интересные результаты были получены у 148 славянских пациенток с семейным и личным анамнезом. В этой группе количество «мутаций основателя» приближалось к 20% (19,5%), а редкие мутации были выявлены у 17,5% больных. Таким образом, с помощью проведения II этапа тестирования мутации BRCA1/BRCA2 были обнаружены в целом у 37% пациенток, т.е. число больных, несущих мутации, практически удвоилось. Полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что проведение полного исследования кодирующей последовательности обоих генов является абсолютно необходимым по крайней мере пациенткам с классическими признаками наследственного рака. К сожалению, пока невозможно сделать какие-либо выводы по двухэтапному анализу материала больных из неславянских этнических групп, поскольку лишь незначительному числу из них к моменту проведения анализа были выполнены оба этапа обследования. Возможно, дальнейшее накопление данных позволит определить соотношение частых и уникальных мутаций, выявляемых только с помощью секвенирования, и в этой группе пациенток. Суммируя итоги проведенной работы в целом, несмотря на то, что не всем пациенткам пока выполнены оба этапа обследования, можно выделить следующие основные результаты: • Патогенные мутации генов BRCA1/BRCA2 были обнаружены у 22% обследованных пациентов (без учета наследственных и этнических факторов). В 78,9% случаев мутации не выявлялись (в 2,4% обнаруживались генетические варианты неясного значения). В 92,5% случаев выявлялись мутации в гене BRCA1, в 6,5% случаев - в гене BRCA2. • Мутации достоверно чаще определялись у больных с семейным анамнезом (28% vs 15%, p<0,001) и у больных с личным анамнезом (27% vs 18%, p=0,02). • Мутации генов BRCA1/BRCA2 значительно чаще выявлялись у пациенток до 50 лет (31% vs 21%, p<0,01), что соответствует ранее полученным данным. • Частота выявления мутаций у больных без семейного и личного анамнеза, а также у пациенток старше 50 лет подтверждает необходимость тестирования всех больных РЯ вне зависимости от приведенных выше факторов. • Результаты гистологического исследования показали, что образцы опухоли больных с мутациями BRCA1/BRCA2 отличались более высокой степенью злокачественности по сравнению с образцами больных без мутаций (29,5% vs 19,5%, p=0,01). Таким образом, первые результаты работы программы по определению мутаций генов BRCA1/BRCA2 у пациенток с платиночувствительным рецидивом РЯ подтвердили высокую частоту их встречаемости при данной патологии. Использование метода секвенирования следующего поколения позволило практически удвоить число носительниц в группе больных с классическими признаками наследственного РМЖ/РЯ и доказало релевантность используемого подхода. Проведение всех этапов тестирования на большей выборке позволит получить новую информацию о частоте встречаемости исследуемых мутаций в разных группах больных и разработать новый алгоритм обследования, который, возможно, позволит улучшить результаты лекарственного лечения у этих пациенток.

About the authors

I A Demidova

The Moscow city cancer hospital No. 62 of the Department of health of Moscow

Email: dema-80@yandex.ru
143423, Russian Federation, pos. Istra, d. 27

References

Supplementary files