Prognostic significance of androgen receptor expression in triple-negative breast cancer

Full Text

Введение

Определение экспрессии рецепторов андрогенов (АР) и связанных с ними сигнальных путей является перспективной задачей онкологов, занимающихся лечением трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ). Данный подтип опухолей характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом и частым метастазированием в легкие, печень, головной мозг и костную систему [1, 2]. В основе прогрессирования ТНРМЖ могут лежать различные молекулярные механизмы, изучение которых представляет собой актуальную научную задачу [3]. Одним из наиболее противоречивых прогностических параметров для ТНРМЖ, по нашему мнению, являются АР. Изучить экспрессию АР в опухоли возможно с помощью иммуногистохимического (ИГХ)-исследования [4] и данных молекулярно-генетического исследования [5]. По мнению одних исследователей – это фактор благоприятного прогноза [6], по мнению других – наоборот [7]. АР могут рассматриваться как дополнительная мишень в лечении ТНРМЖ [8]. Таким образом, мы можем констатировать, что изучение экспрессии АР при ТНРМЖ является важным уточняющим методом диагностики, так как помогает предсказывать прогноз заболевания.

Цель исследования – определить зависимость степени экспрессии AР от различных клинических и молекулярно-генетических характеристик: возраста, размера первичного опухолевого очага, значения суммарного балла злокачественности (СБЗ), числа метастатических лимфоузлов (ЛУ), уровня экспрессии 44 генов.

Материалы и методы

Исследование выполнено на базе кафедры онкологии и лучевой диагностики им. О.П. Модникова медицинского факультета им. Т.З. Биктимирова Института медицины, экологии и физической культуры ФГБОУ ВО УлГУ и ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова». В исследование включены 246 пациентов с ТНРМЖ. Период исследования: 2014–2024 гг. Критерий включения: наличие морфологически подтвержденного ТНРМЖ по данным ИГХ-исследования Т0-4, N0-3, M0-1 стадий. Всем пациентам проводилось клиническое обследование в соответствии с существующими клиническими рекомендациями.

Средний возраст пациентов составил 57,76 года (95% доверительный интервал – ДИ 56,28–59,25). Средние показатели длины опухолевого узла составили 28,26 мм (95% ДИ 26,41–30,11), ширины – 22,34 мм (95% ДИ 20,67–24,08). СБЗ, предложенный в 2009 г. морфологами ГУЗ ОКОД (г. Ульяновск), – морфологический критерий, способный прогнозировать течение инфильтрирующего рака молочной железы. Он складывается из нескольких морфологических параметров: степени дифференцировки опухоли, клеточного полиморфизма, митотической активности опухолевых клеток, характера инвазивного роста, степени лимфогистиоцитарной инфильтрации, наличия опухолевых эмболов в сосудах стромы¹. Среднее значение СБЗ в нашей выборке составило 14,27 балла (95% ДИ 13,96–14,58). Число метастатически измененных ЛУ по данным операционного материала составило в среднем 1,02 (95% ДИ 0,71–1,32).

 

Таблица 1. Распределение пациенток по степени экспрессии АР Table 1. The distribution of patients by the degree of AR expression
Степень экспрессии АР	Абс.	%
Отсутствует/Слабая	204	83
Умеренная/Высокая	42	17

 

В зависимости от степени экспрессии АР все пациенты распределены на 2 группы: 1-я группа – с отсутствием/слабой экспрессий АР; 2-я группа – с умеренной/высокой степенью экспрессии АР. Степень экспрессии АР определялась на основании ранее разработанной методики с использованием данных ИГХ-исследования [9]. Для определения экспрессии АР использовали антитело к АР (клон AЕ441, DAKO, концентрированные мышиные моноклональные антитела, рабочее разведение 1:50). Случаями с положительной экспрессией считали образцы с ≥10% позитивно окрашенных клеток, АР-негативные опухоли определялись при наличии слабого мембранного и цитоплазматического окрашивания менее чем в 10% опухолевых клеток (табл. 1).

У всех пациенток с наличием экспрессии АР определяли 3 степени экспрессии: 0 баллов – отсутствие экспрессии, 1 балл – слабая, 2 балла – умеренная, 3 балла – высокая.

Оценивался уровень экспрессии 44 различных генов, выраженный в ln-шкале. В генетическую панель включены следующие гены: гены рецепторов гормонов (ESR1, PGR), группа генов рецепторов ростовых факторов (ERBB2, GRB7, EGFR, FGFR4), группа генов, регулирующих пролиферацию, митоз, формирование веретена деления и регуляцию клеточного цикла (MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, MYC, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, SFRP1, TMEM45B, TMEM45A, TPX2), группа генов, регулирующих миграцию клеток, инвазию, организацию цитоскелета (MMP11, CTSL2, EMSY, PAK1, ANLN), гены апоптоза (BCL2, BAG1, PTEN), группа генов, регулирующих репликацию и репарацию ДНК (TYMS, EXO1, UBE2T, TPT1), маркеры дифференцировки клеток и коэкспрессированные с ними гены (SCGB2A2, KRT5, MIA), факторы транскрипции (GATA3, FOXA1, ZNF703, NAT1), гены иммунной системы (CD68, TRAC, PD-L1).

Методика молекулярно-генетического исследования заключалась в предварительном выделении РНК c последующей амплификацией комплементарной ДНК (кДНК) опухолевых образцов в режиме реального времени методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Для проведения молекулярно-генетического исследования парафиновые срезы толщиной 4,5 мкм в количестве 3 штук помещали в сухие пластиковые пробирки объемом 1,5 мл. Перед выделением тотальной РНК проводили предварительную изоляцию парафина и обработку образцов протеиназой К с помощью набора реагентов «Проба-ПК», далее использовали наборы реагентов для выделения РНК «Проба НК-плюс», предусматривающие спиртовое осаждение нуклеиновых кислот. Полученные препараты РНК сразу использовали для постановки реакции обратной транскрипции (синтез кДНК из РНК). Амплификацию кДНК осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналам FAM и Cy5 (мультиплексная полимеразная цепная реакция) с использованием детектирующих амплификаторов «ДТпрайм» (приборное обеспечение и наборы производства ООО «НПФ ДНК-Технология», Россия). После завершения амплификации уровень представленности транскриптов рассчитывали методом сравнения индикаторных циклов (метод ∆Cq) с нормировкой относительно референсных генов В2М, GUSB, HPRT1.

Для определения прогностической значимости анализируемых групп проводили анализ общей выживаемости с помощью построения кривых Каплана–Мейера. При сравнении кривых выживаемости использовался лонг-ранговый критерий. Различия между группами считали статистически значимыми при p<0,05.

На все исследования получено разрешение этической комиссии ФГБОУ ВО УлГУ (протокол №12 от 23.12.2017).

В качестве статистического инструмента использовали программу IBMM SPSS Statistics for Windows, version 20.0.

Результаты

На основании полученных данных только переменные «возраст» и «число метастатических регионарных ЛУ» продемонстрировали статистически значимую корреляцию с экспрессией АР (р<0,05). Продемонстрировано, что пациентки с «умеренной/сильной экспрессией АР» были старше и чаще имели поражение регионарного лимфатического коллектора по сравнению с пациентками из группы «отсутствие/слабая экспрессия АР» (табл. 2).

После проверки распределения генов по критерию нормальности (критерий Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса) оказалось, что 9 из 44 генов имели нормальное распределение (p>0,05), а 35 – распределение генов, отличное от нормы (p<0,05).

Соответственно, для поиска зависимостей между уровнем экспрессии АР и генами использовали t-критерий Стьюдента (ERBB2, CTSL2, AURKA, KRT5, CCND1, BCL2, SCGB2A2, FGFR4, TMEM45A) и однофакторный дисперсионный анализ (ESR1, PGR, GRB7, MiKI67, MYBL2, CDKN2A, FOXA1, SFRP1, NAT1, PTEN, CD68, EMSY, GATA3, EXO1, PPP2R2A, TPX2, PAK1, PTTG1, UBE2T, KIF14, CCNB1, MMP11, BAG1, EGFR, TMEM45B, MYC, MIA, BIRC5, PD-L1, TRAC, ZNF703, TYMS, CCNE1, TPT1, ANLN); табл. 3.

 

Таблица 2. Различия между группами в зависимости от значений клинических факторов Table 2. Differences between groups depending on the values of clinical factors
Показатель	Уровень экспрессии АР				р
	отсутствие/слабая экспрессия		умеренная/высокая экспрессия
	M±m	95% ДИ	M±m	95% ДИ
Возраст, полных лет	56,91±0,8	55,33–58,49	64,39±1,84	60,61–68,18	0,002*
Длина узла, мм	28,64±1,03	26,61–30,69	25,28±1,82	21,53–29,03	0,257
Ширина узла, мм	22,63±0,93	20,80–24,73	20,03±1,60	16,74–23,33	0,329
СБЗ, баллы	14,28±0,15	13,97–14,59	14,18±0,61	12,92–15,44	0,839
Число метастатических ЛУ	0,84±0,14	0,56–1,13	2,36±0,77	0,78–3,93	0,002*
*Здесь и далее в табл. 3: различия показателей статистически значимы (р<0,05).

 

Из проанализированных 44 генов только 9 не ассоциировались (р>0,05) со статусом АР: ERBB2, SCGB2A2, ESR1, PGR, GRB7, NAT1, MMP11, EGFR, TPT1.

Анализ выживаемости выполнен на 13.03.2024. Медиана времени наблюдения за пациентами составила 44±5,05 мес (95 ДИ 34,1–53,9 мес). Всего в исследовании зарегистрировано 68 летальных случаев. При построении кривых Каплана–Мейера группы пациентов статистически значимо различались – log-rank test р≤0,05 (рис. 1).

 

Рис. 1. Общая выживаемость пациенток в зависимости от уровня экспрессии АР.

Fig. 1. Overall survival of patients depending on the level of AR expression.

 

Мы можем видеть на рис. 1, что показатели общей выживаемости оказались выше в группе пациенток с отсутствием/слабой экспрессией АР, в то время как пациентки с умеренной/сильной экспрессией демонстрировали худшие показатели выживаемости.

 

Таблица 3. Различия между группами в зависимости от значений различных генов Table 3. Differences between groups depending on the values of different genes
Показатель		Уровень экспрессии АР		р
		отсутствие/слабая экспрессия	умеренная/высокая экспрессия
		M±m	M±m
Нормально распределенные гены	ERBB2	-1,50±0,06	-1,18±0,16	0,105
	CTSL2	-2,90±0,07	-4,28±0,16	0,001*
	AURKA	-3,99±0,05	-4,80±0,18	0,001*
	KRT5	-3,11±0,13	-4,77±0,52	0,001*
	CCND1	-1,10±0,71	-1,15±0,17	0,001*
	BCL2	-4,19±0,72	-4,72±0,17	0,014*
	SCGB2A2	-4,54±0,23	-3,29±0,65	0,065
	FGFR4	-4,82±0,80	-3,80±0,27	0,001*
	TMEM45A	-3,35±0,82	-3,91±0,20	0,013*
Распределение генов, отличное от нормы	ESR1	-4,24±0,93	-3,90±0,27	0,22
	PGR	-6,28±0,08	-6,41±0,25	0,624
	GRB7	-2,44±0,06	-2,60±0,20	0,41
	MiKI67	-2,69±0,61	-4,18±0,24	0,001*
	MYBL2	-1,67±0,55	-2,65±0,19	0,001*
	CDKN2A	-1,24±0,91	-2,38±0,21	0,001*
	FOXA1	-4,44±0,13	-1,69±0,23	0,001*
	SFRP1	-2,24±0,11	-4,15±0,32	0,001*
	NAT1	-6,02±0,07	-6,13±0,20	0,608
	PTEN	-2,49±0,48	-2,80±0,13	0,019*
	CD68	-1,54±0,40	-2,03±0,13	0,001*
	EMSY	-3,24±0,44	-3,68±0,14	0,001*
	GATA3	-4,22±0,84	-3,60±0,21	0,011*
	EXO1	-4,35±0,63	-5,60±0,23	0,001*
	PPP2R2A	-3,17±0,41	-3,74±0,13	0,001*
	TPX2	-2,03±0,61	-3,39±0,21	0,001*
	PAK1	-2,43±0,43	-3,02±0,14	0,001*
	PTTG1	-2,30±0,48	-3,43±0,19	0,001*
	UBE2T	-2,27±0,53	-3,19±0,22	0,001*
	KIF14	-4,97±0,69	-6,36±0,24	0,001*
	CCNB1	-2,43±0,49	-3,49±0,18	0,001*
	MMP11	-3,24±0,12	-2,81±0,23	0,239
	BAG1	-3,01±0,42	-3,63±0,15	0,001*
	EGFR	-2,78±0,77	-3,07±0,30	0,382
	TMEM45B	-6,17±0,14	-3,37±0,34	0,001*
	MYC	-0,72±0,06	-2,04±0,15	0,001*
	MIA	-4,24±0,12	-6,51±0,25	0,001*
	BIRC5	-3,77±0,66	-4,76±0,20	0,001*
	PD-L1	-5,11±0,53	-5,97±0,19	0,001*
	TRAC	-2,33±0,45	-2,77±0,16	0,002*
	ZNF703	-5,47±0,97	-4,90±0,20	0,043*
	TYMS	-3,03±0,57	-4,35±0,18	0,001*
	CCNE	-3,60±0,59	-4,71±0,20	0,001*
	TPT1	-5,30±0,10	-5,44±0,18	0,656
	ANLN	-2,52±0,58	-3,61±0,20	0,001*

 

Обсуждение

Как сказано выше, убедительно судить об экспрессии АР как о прогностически значимом факторе для ТНРМЖ не представляется возможным. В исследовании Х. Luo и соавт. (2010 г.), экспрессия АР коррелировала с улучшением 5-летней общей и безрецидивной выживаемости у пациентов с ТНРМЖ [10]. Кроме выживаемости, продемонстрирована ассоциация экспрессии АР с менопаузальным статусом, степенью дифференцировки опухоли и статусом регионарных ЛУ. Результаты данного исследования перекликаются с результатами нашего исследования. Мы также продемонстрировали статистически достоверную корреляцию экспрессии АР с возрастом пациентов, количеством пораженных регионарных ЛУ и общей выживаемостью.

Положительное прогностическое влияние экспрессии АР на прогноз пациентов с ТНРМЖ продемонстрировано еще в нескольких исследованиях [4, 7]. По мнению М. Pistelli и соавт. (2014 г.), АР могут рассматриваться как дополнительный клинико-морфологический фактор прогноза наравне с индексом пролиферативной активности Ki-67 и лимфоваскулярной инвазией. Однако ни на общую, ни на безрецидивную выживаемость экспрессия АР, по мнению авторов, не влияла [11].

В исследовании, проведенном P. Gasparini и соавт. (2014 г.), продемонстрирована связь между экспрессией АР, степенью дифференцировки опухоли и улучшением общей выживаемости пациентов с ТНРМЖ [12]. Это исследование примечательно тем, что в нем показана позитивная корреляция ИГХ-маркера (положительный статус АР) с различными микро-РНК (HER4, TNFSF10, CDK6, FOXA1). В нашем исследовании удалось продемонстрировать существование позитивной корреляции АР с большим числом (35) генов. Статистически значимая корреляция между экспрессией АР показана со следующими генами: CTSL2, AURKA, KRT5, CCND1, FGFR4, TMEM45A, MiKI67, MYBL2, CDKN2A, FOXA1, SFRP1, PTEN, CD68, EMSY, GATA3, EXO1, PPP2R2A, TPX2, PAK1, PTTG1, UBE2T, KIF14, CCNB1, BAG1, TMEM45B, MYC, MIA, BIRC5, PD-L1, TRAC, ZNF703, TYMS, CCNE, ANLN.

По данным P. Qiu и соавт. (2021 г.), экспрессия АР при ТНРМЖ ассоциируется с молекулярными сигнальными путями (AURKA, TPX2, CCNB1, TYMS), которые рассматриваются в ряде доклинических исследований как мишени для терапии андроген-рецептор-позитивных пациентов с ТНРМЖ [13].

Экспрессия АР при ТНРМЖ ассоциируется с апокриновым морфологическим подтипом, который, в свою очередь, характеризуется высокой частотой экспрессии генов, ответственных за PI3K/Akt-сигнальный путь (PTEN, FGFR4, ERBB2) [14]. Именно этим фактом, по мнению авторов, объясняется особенность ТНРМЖ давать плохой ответ на химиотерапию при наличии благоприятных клинико-морфологических параметров.

Наличие АР и FOXA1 при ТНРМЖ, по мнению S. Guiu и соавт. (2015 г.), придает опухоли черты люминального подтипа (пожилой возраст, низкая степень злокачественности, большое число метастатически измененных ЛУ) [15]. Стоит уточнить, что в данном исследовании статус FOXA1 определялся иммуногистохимически.

Метапластическая гистологическая форма рака молочной железы наиболее часто встречается при ТНРМЖ. Для данного подтипа характерно наличие коэкспрессии АР, PD-L1, TPOP2 (антиген поверхности клеток трофобласта 2-го типа). По мнению S. Chartier и соавт. (2023 г.), данные маркеры могут быть специфичными для этого подтипа опухоли [16].

Заключение

Таким образом, мы можем констатировать, что ТНРМЖ с наличием экспрессии АР является неоднородным подтипом. Он ассоциируется с пожилым возрастом, метастатическим поражением регионарных ЛУ, а также экспрессией большого числа генов. Согласно нашим данным экспрессия АР при ТНРМЖ ассоциируется с неблагоприятным отдаленным прогнозом данной категории пациентов.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. И.С. Панченко – согласие принять на себя ответственность за все аспекты работы и гарантия того, что все вопросы, связанные с точностью и добросовестностью любой части работы, могут быть надлежащим образом исследованы и урегулированы; С.В. Панченко – критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания; М.Г. Шарафутдинов – окончательное утверждение публикуемой версии рукописи; В.В. Родионов – разработка концепции научной работы; В.В. Кометова – анализ и интерпретация данной работы; О.В. Бурменская – статистическая обработка материала.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. I.S. Panchenko – claim responsibility for all aspects of the study and ensure that all issues related to the accuracy and integrity of any part of the work can be properly investigated and resolved; S.V. Panchenko – critical review with the addition of valuable intellectual content; M.G. Sharafutdinov – final approval of the manuscript for publication; V.V. Rodionov – study concept development; V.V. Kometova – review and interpretation of the study; O.V. Burmenskaya – statistical data processing.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information and all of accompanying images within the manuscript.

Соответствие принципам этики. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО УлГУ (протокол №12 от 23.12.2017). Одобрение и процедуру проведения протокола получали по принципам Хельсинкской декларации.

Compliance with the principles of ethics. The study protocol was approved by the local ethics committee of Ulyanovsk State University (Minutes №12 dated 23.12.2017). Approval and protocol procedure was obtained according to the principles of the Declaration of Helsinki.

 

1 Кометова В.В., Занкин В.В., Хайруллин Р.М., Родионов В.В. Способ прогнозирования пятилетней выживаемости пациенток с инфильтрирующим раком молочной железы путем определения суммарного балла злокачественности. Патент России №2547561, 2015. Бюл. №10

About the authors

Ivan S. Panchenko

Ulyanovsk State University; Regional Clinical Oncologic Dispensary

Author for correspondence.
Email: pan91ch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7923-4317
SPIN-code: 3171-5174

Assistant

Russian Federation, Ulyanovsk; Ulyanovsk

Sergei V. Panchenko

Ulyanovsk State University; Regional Clinical Oncologic Dispensary

Email: pan91ch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9006-2023
SPIN-code: 6140-6733

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Ulyanovsk; Ulyanovsk

Marat G. Sharafutdinov

Ulyanovsk State University

Email: pan91ch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8782-4111
SPIN-code: 4904-0615

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Ulyanovsk

Valerii V. Rodionov

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: pan91ch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0096-7126
SPIN-code: 2716-7193

D. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Vlada V. Kometova

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: pan91ch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9666-6875
SPIN-code: 2390-4253
ResearcherId: AAH-4161-2020

Cand. Sci. (Med.)

Russian Federation, Moscow

Olga V. Burmenskaya

Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology

Email: pan91ch@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2842-3980
SPIN-code: 7771-6064

D. Sci. (Biol.)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files