Membrane (CD8⁺PD-1⁺ and CD4+PD-1⁺) and soluble (sPD-1 and sPD-L1) forms of immune checkpoints in melanoma, breast cancer, and oral mucosal cancer patients: A observational study

Full Text

Введение

Опухолевый рост сопровождается как развитием системного иммунного ответа, так и формированием опухолевого микроокружения (локального иммунного ответа), который с помощью различных иммуносупрессивных факторов дезорганизует иммунную систему и обеспечивает ускользание опухоли от иммунологического надзора. Рецептор PD-1 и его лиганд PD-L1 занимают важное место в этом процессе. Взаимодействие PD-1/PD-L1 приводит к подавлению активации и пролиферации антигенспецифических Т-лимфоцитов, нарушению продукции цитокинов, подавлению иммунных ответов и в конечном итоге ‒ к гибели активированных Т-клеток. PD-1 экспрессируется на активированных Т-, В-клетках, моноцитах, дендритных клетках, регуляторных Т-клетках и естественных Т-киллерах, а PD-L1 – на опухолевых клетках, покоящихся Т-, В-клетках, дендритных клетках и макрофагах [1, 2]. Использование блокаторов контрольных точек иммунитета PD-1/PD-L1 в настоящее время – один из наиболее эффективных иммунотерапевтических методов лечения опухолей. Блокада PD-1/PD-L1-пути повышает противоопухолевую активность эффекторных Т-клеток и увеличивает выживаемость пациентов [1–3]. Показано, что ответ на анти-PD-1/PD-L1-терапию зависит не только от свойств опухолевых клеток, но в значительной степени – от микроокружения опухоли, жизненно важным компонентом которого являются лимфоциты, инфильтрующие опухоль (TILs) [4–6]. Наиболее значимая роль в непосредственном уничтожении опухолевых клеток отводится CD8 TILs, высокое содержание которых при ряде опухолей связано с увеличением продолжительности жизни пациентов [7]. Недавние исследования продемонстрировали то, что, помимо мембранных форм, существуют растворимые варианты (soluble) – sPD-1 и sPD-L1. Они могут образовываться в результате 2 процессов: гидролитического отщепления внеклеточного домена мембраносвязанной молекулы или альтернативного сплайсинга мРНК этой нативной мембранной формы [8]. Показано, что при различных новообразованиях уровень растворимых маркеров в периферической крови (ПК) может иметь важное прогностическое значение [9, 10]. Повышение уровня sPD-1 после лечения по сравнению с исходными значениями может указывать на благоприятное течение заболевания [11, 12]. В то же время высокие уровни sPD-1 и sPD-L1 до лечения предсказывают снижение выживаемости пациентов при многих вариантах солидных опухолей [10, 13]. Растворимые варианты, как и мембранные формы PD-1 и PD-L1, обладают иммунорегуляторными свойствами и могут воздействовать как на функцию, так и на количество различных популяций иммунных клеток [14, 15]. В связи с этим исследование взаимосвязи уровня CD8 и CD4 лимфоцитов, экспрессирующих PD-1, и растворимых форм sPD-1 и sPD-L1 с эффекторными и регуляторными популяциями лимфоцитов представляется актуальным.

Цель исследования – изучение взаимосвязи исходного (до лечения) уровня CD8⁺PD-1⁺, CD4⁺PD-1⁺ лимфоцитов и растворимых форм sPD-1 и sPD-L1 с процентным содержанием основных эффекторных и регуляторных популяций лимфоцитов ПК и TILs.

Материалы и методы

Пациенты. В исследование включены пациенты с диссеминированной меланомой (III–IV стадия; Ме возраста – 64,5 года; n=10), раком молочной железы (РМЖ, все подтипы опухоли; I–III стадия; Ме возраста – 48 лет; n=69) и раком слизистой оболочки полости рта (РСОПР, I–IV стадия; Ме возраста – 58 лет; n=19). Все больные проходили лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина». Больные меланомой получали иммунотерапию, больные РСОПР – хирургическое лечение с последующей радио-/химиотерапией, больные РМЖ – неоадъювантную терапию в стандартном режиме в соответствии с подтипом опухоли с последующим хирургическим лечением.

Иммунологические исследования. До начала лечения у больных определяли субпопуляционный состав лимфоцитов ПК и опухолевой ткани (Core-биопсия или операционный материал). У пациентов с меланомой материал получен из образования в мягких тканях (n=4) и метастатических лимфоузлов (n=6). Поскольку статистически значимых различий в субпопуляционном составе лимфоцитов между этими пациентами не было, их объединили в одну группу. Из ПК и клеточной суспензии, полученной из опухолевой ткани, выделяли лимфоциты по параметрам светорассеяния и экспрессии CD45. Проводили 2-, 3- и 4-цветное окрашивание клеток с использованием моноклональных антител (BD Biosciences, Bekman Coulter) к поверхностным [CD3, CD4, CD8, CD28, CD11b, HLA-DR, CD25, CD16, CD56, CD19, CD127, PD-1 (CD279)] и внутриклеточному (Perforin) маркерам лимфоцитов. Процентное содержание лимфоцитов ПК и TILs определяли методом проточной цитофлуориметрии на 5-параметровом проточном цитофлуориметре аналитического типа (FACSCalibur, Becton Dickinson, США) [16]. В составе CD45⁺CD8⁺ лимфоцитов исследовали различия в процентном содержании CD8⁺CD11b⁺CD28^‒ (эффекторы), CD8⁺CD11b^-CD28⁺ (наивные), CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ (цитотоксические/памяти) и CD8⁺CD11b^-CD28^- (регуляторные) Т-клеток в ПК и опухоли и влияние на уровень этих популяций растворимых форм sPD-1 и sPD-L1. Концентрации белков sPD-1 и sPD-L1 исследовали в сыворотке крови, полученной по стандартной методике до начала специфического лечения, с помощью наборов реактивов для иммуноферментного анализа Human PD-L1 Platinum ELISA, Human PD-1 ELISA kit (Affimetrix, eBioscience, США) в соответствии с инструкциями производителя. Измерения проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе BEP 2000Advance (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Германия). Содержание маркеров выражали в пикограммах (пг) на 1 мл сыворотки крови [8, 9].

Статистический анализ данных проводили с помощью программы Statistica 7.0. Для установления характера распределения показателей при n<50 использовали критерий Шапиро–Уилка, при n≥50 – Колмогорова–Смирнова. В связи с тем, что сравниваемые группы различались по виду распределения показателей, для характеристики каждой выборки использовали медиану (Mе) и квартили (25 и 75-й процентили), а для определения статистической значимости различий между группами – непараметрические критерии: для независимых групп двусторонний U-критерий Манна–Уитни (U); для зависимых групп (ПК и опухоль; до и после лечения) – критерий знаковых рангов Вилкоксона. Взаимосвязь между показателями определяли с помощью корреляционного анализа Спирмена [коэффициент корреляции ρ и 95% доверительный интервал ρ (95% ДИ)]. Значение вероятности p=0,05.

Результаты

Проведенное исследование показало, что у больных меланомой в ПК уровень CD8⁺CD279⁺ Т-лимфоцитов положительно коррелировал с процентным содержанием CD3⁺HLA-DR⁺, CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ и CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-клеток. У больных РМЖ эти клетки положительно коррелировали с активированными CD4⁺CD25⁺ лимфоцитами и с CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ популяцией (табл. 1). При РМЖ в ПК и опухоли и при РСОПР в ПК наблюдалась положительная взаимосвязь CD8⁺CD279⁺ и CD4⁺CD279⁺ друг с другом (табл. 1 и 2).

 

Таблица 1. Корреляционная взаимосвязь уровня некоторых популяций лимфоцитов ПК больных меланомой, РМЖ и РСОПР с CD8⁺CD279⁺ и CD4⁺CD279⁺ Т-клетками Table 1. Correlation between the level of some populations of peripheral blood lymphocytes (PBL) in patients with melanoma, breast cancer (BC), and cancer of the oral mucosa with CD8⁺CD279⁺ and CD4⁺CD279⁺ T cells
Показатель, %	n	ρ (95% ДИ)*	p**
Меланома
		С CD8⁺CD279⁺
CD3⁺HLA-DR⁺	10	0,842 (0,403; 1,000)	0,002
CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	10	0,867 (0,263; 1,000)	0,002
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	10	0,883 (0,526; 1,000)	0,002
РМЖ
		С CD8⁺CD279⁺
CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	69	0,320 (0,082; 0,538)	0,007
CD4⁺CD25⁺	69	0,403 (0,185; 0,560)	0,001
CD4⁺CD279⁺	69	0,606 (0,398; 0,765)	0,000
sPD-L1	69	-0,361 (-0,536; -0,143)	0,002
РСОПР
		С CD8⁺CD279⁺
CD4⁺CD279⁺	18	0,744 (0,407; 0,895)	0,000
Примечание. Здесь и далее в табл. 2 и 5: *коэффициент корреляции Спирмена, **статистическая значимость.

 

Таблица 2. Корреляционная взаимосвязь уровня некоторых популяций TILs больных меланомой, РМЖ и РСОПР с CD8⁺CD279⁺ и CD4⁺CD279⁺ Т-клетками Table 2. Correlation of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma, BC, and oral mucosal cancer patients with CD8⁺CD279⁺ and CD4⁺CD279⁺ lymphocytes
Показатель, %	n	ρ (95% ДИ)*	p**
Меланома
		С CD8⁺CD279⁺
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	10	0,845 (0,393; 1,000)	0,002
		С CD4⁺CD279⁺
CD4⁺CD25⁺	10	0,857 (0,346; 1,000)	0,002
РМЖ
		С CD8⁺CD279⁺
CD3⁺CD8⁺	44	0,436 (0,056; 0,722)	0,003
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	41	0,497 (0,183; 0,713)	0,001
CD4⁺CD279⁺	48	0,606 (0,373; 0,757)	0,000
		С CD4⁺CD279⁺
CD4⁺CD25⁺	40	0,507 (0,228; 0,710)	0,001
РСОПР
		С CD8⁺CD279⁺
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	11	0,782 (0,408; 0,923)	0,004

 

В опухолевой ткани отмечалась положительная взаимосвязь между повышением уровня CD8⁺CD279⁺ лимфоцитов у больных меланомой, РМЖ и РСОПР и увеличением процентного содержания CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-клеток. Наблюдалась корреляция CD4⁺CD279⁺ лимфоцитов с активированными CD4⁺CD25⁺ Т-клетками (см. табл. 2).

Влияние уровня растворимых форм sPD-L1 и sPD-1 в сыворотке крови больных на популяции лимфоцитов обнаружено только при РМЖ и РСОПР (табл. 3 и 4).

 

Таблица 3. Процентное содержание популяций лимфоцитов ПК в зависимости от уровня sPD-L1 и sPD-1 в сыворотке крови больных РМЖ Table 3. Percentage of PBL populations depending on the level of sPD-L1 and sPD-1 in the blood serum of BC patients
Лимфоциты ПК, %	РМЖ
	Me (квартили), пг/мл*		p***
	sPD-L1<Me**, n=35	sPD-L1≥Me**, n=35
CD19	5,3 (1,1–7,3)	1,3 (0,6–5,0)	0,006
CD25	22,7 (15,4–29,8)	17,0 (14,2–21,1)	0,016
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	5,9 (3,4–8,3)****	9,1 (5,7–15,6)****	0,015
CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	10,3 (6,7–14,0)****	7,1 (5,2–10,1)****	0,030
CD8⁺CD279⁺	3,3 (1,0–5,4)	1,6 (0,7–3,0)	0,028
sPD-1, пг/мл	44,3 (32,5–54,7)	54,2 (49,2–99,7)	0,000
Показатель	sPD-1<Me** n=35	sPD-1≥Me** n=35	p
CD19	5,7 (1,2–8,4)	1,2 (0,6–3,8)	0,000
CD25	22,5 (16,2–29,8)	17,5 (14,3–21,2)	0,027
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	5,9 (3,3–8,1)****	9,8 (5,7–15,2)****	0,005
sPD-L1, пг/мл	6,1 (4,8–7,3)	8,4 (6,7–11,0)	0,000
Примечание. Здесь и далее в табл. 4: *медиана (25 и 75-й процентили), **Me sPD-L1=7,0 пг/мл, Me sPD-1=49,7 пг/мл, ***статистическая значимость, ****данные представлены в виде процентного содержания популяции в составе CD8 лимфоцитов.

 

Таблица 4. Процентное содержание популяций лимфоцитов ПК в зависимости от уровня sPD-L1 и sPD-1 в сыворотке крови больных РСОПР Table 4. Percentage of PBL populations depending on the level of sPD-L1 and sPD-1 in the blood serum of oral mucosal cancer patients
РСОПР
Лимфоциты ПК, %	Me (квартили), пг/мл*
	sPD-L1<Me**, n=9	sPD-L1≥Me**, n=10	p***
CD8	33,4 (30,0–36,5)	26,7 (22,8–28,4)	0,010
CD8⁺CD28⁻CD11b⁻	5,3 (4,0–7,1)****	7,9 (7,0–10,3)****	0,035
sPD-1, пг/мл	49,7 (44,8–61,4)	67,1 (38,5–90,3)	0,000
	sPD-1<Me**, n=9	sPD-1≥Me**, n=10
CD8⁺CD279⁺	4,6 (3,2–6,3)	0,85 (05–2,7)	0,015
CD4⁺CD279⁺	7,1 (5,9–9,1)	4,1 (2,3–4,4)	0,015
sPD-L1, пг/мл	6,8 (6,3–8,4)	8,9 (5,8–13,4)	0,000

 

При РМЖ на фоне более высокой концентрации (≥Me) sPD-L1 отмечалось увеличение процентного содержания CD8⁺CD11b^-CD28^- лимфоцитов и снижение уровня CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ Т-клеток в составе CD8 лимфоцитов (см. табл. 3). У больных РСОПР повышенный уровень sPD-L1 (≥Me), как и при РМЖ, сочетался с повышенным процентом CD8⁺CD28^-CD11b^- Т-клеток в ПК и снижением общего числа CD8 клеток (см. табл. 4). При РМЖ и РСОПР отмечена отрицательная взаимосвязь концентрации растворимой формы sPD-1 с процентным содержанием лимфоцитов ПК, экспрессирующих эту молекулу (CD8⁺CD279⁺ и CD4⁺CD279⁺); см. табл. 3 и 4.

Исследование функционального потенциала CD8 популяций лимфоцитов показало, что в ПК CD8⁺Perforin⁺ клетки статистически значимо положительно коррелировали с CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-лимфоцитами только при РМЖ и РСОПР (табл. 5, а), а в опухолевой ткани – только при меланоме (см. табл. 5, b). Взаимосвязь CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ лимфоцитов с CD8⁺Perforin⁺ популяцией во всех случаях отсутствовала (см. табл. 5).

 

Таблица 5. Корреляция CD8⁺Perforin⁺ лимфоцитов с CD8⁺CD11b⁺CD28- и CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ Т-лимфоцитами в ПК (a) и в опухолевой ткани (b) Table 5. Correlation of CD8⁺Perforin⁺ lymphocytes with CD8⁺CD11b⁺CD28- and CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ T-lymphocytes in PB (a) and in tumor tissue (b)
	Меланома		РМЖ		РСОПР
а) Корреляция CD8⁺Perforin⁺ лимфоцитов ПК
	p (95% ДИ)* n=10	p**	ρ (95% ДИ)* n=69	p**	ρ (95% ДИ)* n=19	p**
С CD8⁺CD11b⁺CD28⁻	0,389 (-0,097; 0,862)	0,144	0,578 (0,391; 0,730)	0,000	0,654 (0,228; 0,860)	0,002
С CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	0,167 (-0,455; 0,758)	0,532	0,125 (-0,146; 0,366)	0,308	-0,111 (-0,569; 0,377)	0,652
b) Корреляция CD8⁺Perforin⁺ TILs
	p (95% ДИ)* n=9	p**	ρ (95% ДИ)* n=16	p**	ρ (95% ДИ)* n=9	p**
С CD8⁺CD11b⁺CD28⁻	0,556 (0,097; 0,935)	0,037	0,278 (-0,284;0,723)	0,297	-0,427 (-0,947; 0,351)	0,252
С CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	0,222 (-0,354; 0,714)	0,404	-0,187 (-0,653; 0,358)	0,488	-0,268 (-0,852; 0,403)	0,486

 

Процентное содержание эффекторных CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клеток у всех исследованных больных в составе TILs было снижено, а регуляторных CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-лимфоцитов – повышено по сравнению с ПК. В составе TILs процентное содержание CD8⁺PD-1⁺ лимфоцитов также было значительно выше, чем в ПК (табл. 6).

 

Таблица 6. Уровень CD8⁺CD11b⁺CD28⁻, CD8⁺CD11b⁻CD28⁻, CD8⁺CD11b⁻CD28⁺, CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ и CD8⁺CD279⁺ лимфоцитов в ПК и опухолевой ткани Table 6. Level of CD8⁺CD11b⁺CD28⁻, CD8⁺CD11b⁻CD28⁻, CD8⁺CD11b⁻CD28⁺, CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ and CD8⁺CD279⁺ PBL and tumor tissue
Популяции лимфоцитов в составе CD45⁺CD8⁺ клеток, %	Лимфоциты ПК	TILs	p
	Ме (квартили), %
Меланома, n=10
CD8⁺CD11b⁺CD28⁻	51,4 (36,2–69,6)	15,2 (4,9–24,0)	0,000
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	10,1 (7,3–13,2)	38,0 (26,7–45,1)	0,002
CD8⁺CD11b⁻CD28⁺	28,2 (16,6–32,2)	34,1 (29,3–54,7)	0,000
CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	5,6 (2,8–8,3)	10,5 (8,3–11,4)	0,029
CD8⁺CD279⁺	2,0 (1,3–3,7)	10,7 (6,0–25,1)	0,004
РМЖ, n=43
CD8⁺CD11b⁺CD28⁻	44,9 (35,0–51,3)	18,3 (12,5–27,3)	0,000
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	7,0 (3,9–11,3)	44,4 (30,4–53,2)	0,000
CD8⁺CD11b⁻CD28⁺	37,2 (26,2–49,1)	24,0 (15,7–30,0)	0,000
CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	8,9 (6,3–12,4)	11,9 (7,2–15,8)	0,016
CD8⁺CD279⁺	1,6 (0,8–3,9)	13,1 (6,1–23,2)	0,000
РСОПР, n=13
CD8⁺CD11b⁺CD28⁻	52,3 (43,6–62,6)	11,5 (8,9–18,5)	0,001
CD8⁺CD11b⁻CD28⁻	7,1 (4,2–7,5)	40,9 (31,3–52,8)	0,001
CD8⁺CD11b⁻CD28⁺	30,2 (23,8–38,4)	37,9 (18,6–52,4)	0,753
CD8⁺CD11b⁺CD28⁺	8,8 (6,5–10,7)	8,2 (6,4–19,2)	0,600
CD8⁺CD279⁺	2,9 (0,7–4,6)	12,5 (6,1–22,5)	0,004

 

У 7 пациентов с меланомой и 8 пациентов с РМЖ исследовали уровень растворимых форм sPD-L1 и sPD-1 до и после лечения (табл. 7).

 

Таблица 7. Изменение уровня sPD-L1 и sPD-1 у больных меланомой и РМЖ после лечения Table 7. Changes in the level of sPD-L1 and sPD-1 in melanoma and BC patients after treatment
Показатель	Me (квартили), пг/мл		p
Меланома
	до лечения, n=7	после лечения, n=7
sPD-L1	8,77 (8,0–9,7)	10,3 (8,8–14,3)	0,018
sPD-1	70,7 (62,3–93,0)	294,0 (238,0–462,6)	0,018
РМЖ
	до лечения, n=8	после лечения, n=8
sPD-L1	7,9 (6,3–11,1)	7,7 (6,1–12,1)	0,779
sPD-1	57,9 (49,7–74,6)	36,0 (19,4–87,3)	0,575

 

У больных меланомой после лечения отмечалось повышение уровня sPD-L1 и sPD-1 по сравнению с исходными показателями (см. табл. 7). Наиболее значительным было повышение уровня sPD-1: медиана возросла в 4 раза. У пациентов с РМЖ изменения этих маркеров после лечения не наблюдалось. У больных РСОПР растворимые формы исследовали только до лечения.

Обсуждение

Проведенное исследование посвящено изучению взаимосвязи исходного уровня CD8⁺PD-1⁺, CD4⁺PD-1⁺ лимфоцитов и растворимых форм sPD-1 и sPD-L1 с процентным содержанием основных эффекторных и регуляторных популяций лимфоцитов ПК и TILs у больных меланомой, РМЖ и РСОПР.

Обнаружено, что в ПК и в опухолевой ткани уровень CD8⁺PD-1⁺ клеток положительно взаимосвязан с определенными популяциями CD8 лимфоцитов, в ПК у больных меланомой – с CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ и CD8⁺CD11b^-CD28^- популяциями, а при РМЖ – с CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ популяцией лимфоцитов. Популяция CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ Т-клеток, по данным S. Fiorentini и соавт. [17], в норме обладает всеми функциями эффекторных клеток: продуцирует интерферон γ, экспрессирует гранулы перфорина in vivo и проявляет мощную цитолитическую активность. Однако в настоящем исследовании мы не выявили статистически значимой взаимосвязи этих клеток с CD8⁺Perforin⁺ лимфоцитами при всех вариантах опухолей ни в ПК, ни в составе TILs, что, возможно, указывает на нарушение их функциональной активности.

В опухолевой ткани отмечалась положительная корреляция CD8⁺PD-1⁺ лимфоцитов с популяцией CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-клеток при всех включенных в исследование нозологических формах опухолей. CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-лимфоциты, по-видимому, представляют собой терминальную дифференцированную популяцию CD8 Т-клеток с нарушенными цитотоксическими свойствами, и, по данным M. Freedman и соавт., способными проявлять супрессорную активность [18, 19]. Показано, что экспрессия PD-1 на Т-лимфоцитах – один из признаков истощения и неблагоприятного изменения их функциональных характеристик [20]. Обнаруженная в работе положительная ассоциация CD8⁺CD279⁺ и CD4⁺CD279⁺ Т-лимфоцитов с Т-клетками, экспрессирующими активационные маркеры HLA-DR и CD25, вполне закономерна: CD279 является активационным маркером и отсутствует на наивных или находящихся в покое Т-клетках.

Растворимые варианты sPD-1 и sPD-L1, как и мембранные формы, обладают иммунорегуляторными свойствами [14, 15]. Показано, что sPD-1 и sPD-L1 могут обеспечивать негативные сигналы и эффективно подавлять функцию и пролиферацию Т- и В-клеток, снижать их количество, подавлять секрецию цитокинов: интерлейкина-2, интерлейкина-10 и интерферона γ – и связываться с растворимыми рецепторами или лигандами, предотвращая их связывание с молекулами мембранного типа [14–16, 21]. Полученные результаты показали, что повышенный уровень растворимых форм sPD-1 или sPD-L1 при РМЖ и РСОПР сочетался с повышенным количеством супрессорных CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-лимфоцитов в составе CD8 клеток. Повышение процентного содержания клеток этой популяции на фоне высокого уровня растворимой формы sPD-L1 сочеталось со снижением общего числа CD8 лимфоцитов (за счет несупрессорных популяций) при РСОПР и процента CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ Т-клеток в составе CD8 лимфоцитов при РМЖ. Кроме того, при РМЖ уровень обеих растворимых форм был отрицательно взаимосвязан также с процентом CD19 B-клеток. Значительное число исследований продемонстрировало благоприятное значение B-клеток для прогноза заболевания при различных типах злокачественных опухолей, и снижение их числа может являться негативным фактором [22–24]. Снижение количества CD8 Т-клеток и В-лимфоцитов при высоком уровне sPD-L1 продемонстрировано Y. Xing и соавт. у больных раком легкого [14]. При высоких исходных уровнях sPD-1 и sPD-L1 при РМЖ наблюдалось также снижение процентного содержания активированных CD25 лимфоцитов. Ранее мы обнаружили, что снижение количества лимфоцитов ПК, экспрессирующих маркер ранней активации CD25⁺, до начала химиотерапии являлось неблагоприятным фактором и сочеталось со статистически значимым уменьшением безрецидивной и общей выживаемости пациенток с трижды негативным РМЖ [25].

Наиболее значимая роль в непосредственном уничтожении опухолевых клеток отводится CD8 Т-клеткам. При этом значение имеет не только их уровень в ПК, и особенно в опухолевой ткани, но и их функциональная активность [7]. Мы исследовали функциональный потенциал CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клеток: определялась корреляция CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клеток с CD8⁺Perforin⁺ лимфоцитами. По данным различных авторов, CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-лимфоциты, экспрессирующие маркер CD11b, обладают высокой цитотоксической активностью [17, 26, 27]. В ПК у больных РМЖ и РСОПР отмечалась статистически значимая положительная корреляция CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клеток с CD8⁺Perfоrin⁺ популяцией, однако в опухоли эта взаимосвязь исчезала. Таким образом, при РМЖ и РСОПР CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клетки, по-видимому, теряют свою эффективность в опухолевом микроокружении, которое при различных опухолях в значительном числе случаев является иммуносупрессивным. В то же время при меланоме взаимосвязь CD8⁺Perfоrin⁺ лимфоцитов с CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клетками в ПК отсутствовала, но обнаружена в опухолевой ткани. Злокачественная меланома – высокоиммуногенная опухоль из-за невероятно высокой геномной мутационной нагрузки, которая обладает наивысшим потенциалом вызывать специфические адаптивные противоопухолевые иммунные ответы [28]. Возможно, с этим в определенной степени связано то, что только при меланоме в опухолевой ткани наблюдалась положительная корреляция CD8⁺Perfоrin⁺ лимфоцитов с CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клетками. Между тем число пациентов с меланомой было небольшим, и для подтверждения полученного результата требуется большее число наблюдений. Следует отметить, что у всех обследованных больных в опухолевой ткани менялся состав CD8 лимфоцитов в сторону значительного снижения процента цитотоксических CD8⁺CD11b⁺CD28^- Т-клеток и повышения числа регуляторных CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-лимфоцитов по сравнению с ПК. Отмечалось также повышение при меланоме и РМЖ процента функционально неактивных CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ Т-клеток. Важно подчеркнуть, что в составе TILs процентное содержание CD8⁺PD-1⁺ лимфоцитов значительно выше, чем в ПК, что указывает на преимущественно дисфункциональное состояние этих клеток.

У 7 пациентов с меланомой и пациентов с РМЖ исследовали уровень растворимых форм sPD-L1 и sPD-1 до и после лечения. У больных с меланомой после лечения отмечалось повышение уровня sPD-L1 и sPD-1 по сравнению с исходными значениями. Наиболее значительным было повышение уровня sPD-1: медиана возросла в 4 раза. У пациентов с РМЖ изменения этих маркеров после лечения не наблюдалось. В нашу задачу не входило определение значения изменений уровня этих факторов для эффекта терапии. В то же время полученные результаты согласуются с данными литературы о возможном влиянии противоопухолевой терапии на уровень растворимых форм sPD-L1 и sPD-1. По данным авторов [11, 12], высокий уровень sPD-1 после лечения является благоприятным прогностическим фактором.

Заключение

Экспрессия PD-1 на Т-лимфоцитах является одним из признаков истощения и снижения их функциональных свойств. Обнаружены различия во взаимосвязи CD8⁺PD-1⁺ клеток с популяциями CD8 лимфоцитов у больных с разными нозологическими формами в ПК. У пациентов с меланомой CD8⁺PD-1⁺ клетки положительно коррелировали с популяциями CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ и CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-лимфоцитов, а при РМЖ – с CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ лимфоцитами. В опухолевой ткани при всех нозологических формах отмечалась положительная корреляция CD8⁺PD-1⁺ клеток с регуляторными терминально дифференцированными CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-клетками. Полученные данные подтверждают также наличие у растворимых форм sPD-1 и sPD-L1 иммунорегуляторных свойств: положительная взаимосвязь уровня данных маркеров с процентным содержанием супрессорных CD8⁺CD11b^-CD28^- Т-клеток и отрицательная – с уровнем CD8 лимфоцитов, CD8⁺CD11b⁺CD28⁺ Т-клеток цитотоксических/памяти, В-клеток и активированных CD25 лимфоцитов. Результаты проведенного исследования могут внести определенный вклад в изучение прогностической значимости мембранных и растворимых форм sPD-1 и sPD-L1 с учетом особенностей их взаимосвязи с супрессорными и эффекторными популяциями лимфоцитов системного и локального иммунитета.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы. Т.Н. Заботина – разработка плана исследования, работа над текстом статьи; утверждение текста статьи; А.И. Черткова – анализ и интерпретация данных, написание текста рукописи; А.А. Борунова, Е.Н. Захарова, Э.К. Шоуа – статистическая обработка результатов, редактирование текста статьи; Н.Е. Кушлинский, Е.С. Герштейн – анализ полученных данных; В.Т. Циклаури, И.В. Самойленко, М.В. Хорошилов – сбор клинических данных для анализа; З.Г. Кадагидзе – работа с литературой; научное редактирование рукописи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors contributed substantially to the study and preparation of the paper, approved the final version of the paper prior to publication, and agreed to be responsible for all aspects of the work, implying proper review and resolution of issues related to the accuracy or integrity of any part of the study. T.N. Zaborina – development of a research plan, work on the text of the article; approval of the text of the article; A.I. Chertkova – analysis and interpretation of data, writing the text of the manuscript; A.A. Borunova, E.N. Zakharova, E.K. Shoua – statistical processing of the results, editing the text of the article; N.E. Kushlinskii, E.S. Gershtein – analysis of the obtained data; V.T. Tsiklauri, I.V. Samoylenko, M.V. Khoroshilov – collection of clinical data for analysis; Z.G. Kadagidze – work with literature; scientific editing of the manuscript.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Информированное согласие на публикацию. Пациенты подписали форму добровольного информированного согласия на публикацию медицинской информации.

Consent for publication. Written consent was obtained from the patients for publication of relevant medical information.

About the authors

Tatiana N. Zabotina

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: tatzabotina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7631-5699

d. sci. (biol.)

Russian Federation, Moscow

Antonina I. Chertkova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: antcher@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9146-5986

cand. sci. (med.)

Russian Federation, Moscow

Anna A. Borunova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: borunova-a@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1854-3455

cand. sci. (med.)

Russian Federation, Moscow

Nikolay E. Kushlinskii

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: biochimia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3898-4127

d. sci. (med.), prof., acad. RAS

Russian Federation, Moscow

Elena S. Gershtein

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: esgershtein@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3321-801X

d. sci. (biol.), prof.

Russian Federation, Moscow

Elena N. Zakharova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: zakharovaen@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2790-6673

cand. sci. (med.)

Russian Federation, Moscow

Esma K. Shoua

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: essfires@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3937-474X

oncologist

Russian Federation, Moscow

Vasily T. Tsiklauri

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: Tvtsiklauri@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3090-695X

oncologist

Russian Federation, Moscow

Igor V. Samoylenko

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: i.samoylenko@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0001-7150-5071

cand. sci. (med.)

Russian Federation, Moscow

Maxim V. Khoroshilov

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: maximkhoroshilov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3770-5173

oncologist

Russian Federation, Moscow

Zaira G. Kadagidze

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: kad-zaira@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0058-0987

d. sci. (med.), prof.

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files