Dynamics of circulating tumor cells during neoadjuvant chemotherapy in patients with locally-advanced breast cancer

Full Text

Введение Одно из первых систематических исследований циркулирующих в периферической крови онкологических больных опухолевых клеток (циркулирующих опухолевых клеток - ЦОК) было проведено J.Pool и соавт. в 1934 г. [1]. Авторы исследования выявили клетки, похожие по форме на клетки первичной опухоли, в крови 17 из 40 обследованных пациентов с распространенными формами рака. Однако до конца XX в. не было разработано технологий, позволяющих с достаточной точностью выделять из кровотока и анализировать свойства ЦОК. В последние годы в результате произошедшего технологического скачка проведен целый ряд исследований, посвященных методологии выделения ЦОК и их клиническому значению при разных формах злокачественных опухолей. Показано, что ЦОК представляют собой гетерогенную популяцию: это эпителиальные, мезенхимальные и стволовые опухолевые клетки, клетки с гибридным эпителиальномезенхимальным фенотипом, а также опухолевые микроэмболы [2]. Известно, что ЦОК в большинстве случаев несколько больше по размеру, чем обычные форменные элементы крови [3], и, кроме того, экспрессируют на своей поверхности различные молекулы, которые могут быть маркерами для выделения клеток. Эти особенности положены в основу разнообразных фильтрационных и иммуномагнитных методов изоляции ЦОК. В 2004 г. M.Cristofanilli и соавт. провели основополагающее исследование ЦОК у больных раком молочной железы (РМЖ) с использованием иммуномагнитной методики выделения ЦОК CellSearch и показали, что циркулирующие эпителиальные клетки, обнаруженные с помощью Cell- Search, практически не встречались у здоровых женщин и у пациенток с доброкачественными заболеваниями молочной железы. Был также установлен пороговый уровень ЦОК в крови, имеющий прогностическое значение при диссеминированном РМЖ. Больные диссеминированным РМЖ с количеством ЦОК<5 на 7,5 мл крови имели большую общую продолжительность жизни (18 и 10,1 мес) и более длительный безрецидивный интервал (7,0 и 2,7 мес) по сравнению с больными, у которых число ЦОК было больше [4]. В настоящее время считается, что наличие клеток опухоли в периферической крови больных РМЖ не зависит от возраста, менструальной функции, стадии, гистологического типа опухоли, уровня экспрессии рецепторов прогестерона, c- erbB2, p53 и Ki67, однако является фактором неблагоприятного прогноза [5]. Наличие ЦОК является прогностическим маркером раннего рецидива, а их содержание в крови может меняться в зависимости от эффективности проводимой лекарственной терапии. Нами с помощью фильтрационной технологии изоляции клеток по размеру (isolation by sizе of tumor cells - ISET) изучена динамика ЦОК, выделенных из крови 59 пациенток с местно-распространенным РМЖ, получавших предоперационное лекарственное лечение. Материалы и методы В наше исследование были включены 59 женщин с гистологически верифицированным РМЖ и наличием показаний к проведению предоперационной химиотерапии на первом этапе лечения, подписавших информированное согласие для участия в исследовании. Возраст больных на момент постановки диагноза варьировал в пределах от 30 до 81 года (медиана возраста 54 года). Пациентки получали предоперационное лечение, включавшее агенты антрациклинового (37/62,7%) и таксанового (14/23,7%) ряда или их комбинацию (8/13,6%). У 3 пациенток с HER2-позитивным РМЖ химиотерапия дополнялась включением трастузумаба в неоадъювантном режиме. Для оценки эффективности лечения использовались стандартные (физикальный осмотр, маммография, ультразвуковое исследование молочных желез и регионарных зон) и дополнительные методы: магнитно-резонансная маммография молочных желез с контрастированием, магнитно-резонансная спектроскопия, магнитно-резонансная диффузия, определение ЦОК по методике БЕТ, определение циркулирующей опухолевой ДНК. Исследования ЦОК проводились в 3 этапа: до начала лечения, после 2 курсов химиотерапии (для оценки раннего ответа) и по окончании лечения. Ответ опухоли на лечение определялся в соответствии с критериями КЕСБТ и сравнивался со степенью патоморфологического ответа по Лавниковой. Для выделения ЦОК всем женщинам производился забор 10 мл венозной крови в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой, после чего в течение 30-60 мин кровь доставлялась в лабораторию. Далее в соответствии с методологией БЕТ (рис. 1, 2) кровь разводили буферным гемолитическим раствором, после чего с помощью отрицательного давления проводили фильтрацию через поликарбонатную мембрану с калиброванными порами диаметром 8 мкм. После промывки и окраски полученной мембраны препараты анализируются цитологически, проводятся идентификация клеток и их подсчет (рис. 3). В нашей работе были использованы следующие цитологические критерии злокачественности выявленных клеток (не менее 4 из 5) [6]: анизонуклеоз, размер ядра более 16 мкм, нерегулярность ядерного контура, наличие клеточных комплексов, высокое нуклеарно-цитоплазматическое отношение. При наличии меньшего числа критериев клетка признается атипичной. Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью программы SPSSv22. Использовали методы описательной статистики, для определения различий между группами применяли непараметрические критерии Манна- Уитни и хи-квадрат. Для проверки характера распределения применяли одновыборочный критерий Колмогорова- Смирнова. Учитывая непараметрический характер распределения, определяли наличие корреляционной зависимости между динамикой ЦОК и наличием выраженного опухолевого патоморфоза с помощью г-критерия Спирмена. Значимыми считали различия при р<0,05. Результаты Полный патоморфологический ответ на лечение (4-я степень лечебного патоморфоза по шкале Лавниковой) был достигнут у 9 (15%) пациенток, из них 7 имели тройной негативный фенотип опухоли; у 14 (24%) пациенток отмечена 3-я степень лечебного патоморфоза. Отсутствие ответа опухоли на лечение (0-1-я степень по Лавниковой) наблюдалось у 6 (10%) женщин и коррелировало с данными клинического обследования в процессе лечения. Оценка динамики ЦОК: клетки не определялись исходно у 37 (63%) пациенток, в том числе у 18 (31%) они отсутствовали в ходе всего исследования, а у 19 (32%) появились в процессе терапии. ЦОК определялись исходно у 22 (37%) пациенток, у 16 (27%) из которых они исчезли в процессе лечения и у 6 (10%) определялись на всех этапах работы. Наличие ЦОК до начала лечения, по нашим данным, не зависело от подтипа опухоли, наличия отека кожи, индекса пролиферации, а также возраста и менопаузального статуса женщины. Было отмечено, что исходно ЦОК чаще выявлялись у пациенток со стабилизацией заболевания или частичным регрессом опухоли в процессе химиотерапии (по данным клинического обследования) и слабым патоморфологическим ответом опухоли на лечение (0-2-я степень): 15 из 37 (41%) против 7 из 22 (32%), хотя статистически значимых различий по этому показателю отмечено не было. Была установлена прямая корреляционная зависимость между исходным наличием ЦОК и максимальным размером опухолевого узла по данным ультразвукового исследования (пороговое значение - 2,5 см), а также клинической стади- ей заболевания. Так, ЦОК были выявлены исходно у 15 из 29 пациенток с III стадией рака и лишь у 7 из 30 больных со II стадией заболевания (р<0,05). При анализе распределения больных по группам в зависимости от степени лечебного патоморфоза по шкале Лавниковой наблюдалась более частая элиминация клеток в процессе лечения у больных с более агрессивными подтипами РМЖ - тройным негативным и люминальным В-Нег2- отрицательным (42% случаев исчезновения ЦОК в процессе неоадъювантной полихимиотерапии), что коррелировало с большей частотой полных регрессов по данным клинического обследования. Проведен анализ корреляции между биологическими особенностями опухоли (экспрессия рецепторов эстрогенов, прогестерона, Нег2, индекс Ю-67), динамикой ЦОК и патоморфологическим ответом. У пациенток с экспрессией Нег2-рецептора независимо от степени экспрессии выявлена сильная корреляционная зависимость (коэффициент корреляции Спирмена более 0,79) между исчезновением ЦОК после 2 первых циклов и 3-4-й степенью патоморфологического ответа. Медиана наблюдения в данной когорте пациенток составила 18,5 мес. Прогрессирование отмечено у 3 пациенток (у всех - 2-я степень лекарственного патоморфоза), исходно ЦОК выявлялись у одной из них. Обсуждение На сегодняшний день общепринятым является представление о том, что ЦОК - ведущий компонент метастатического каскада [7]. Установлено, что для осуществления процесса метастазирования опухолевые клетки последовательно претерпевают эпителиально-мезенхимальный переход, приобретая в кровотоке мезенхимальные признаки, и затем обратную трансформацию для «укоренения» в метастатической нише [2]. Феномен эпителиально-мезенхимального перехода повышает необходимость выявления в кровотоке ЦОК с различными, в том числе мезенхимальными, маркерами. Кроме того, речь идет о выявлении единичных опухолевых клеток в среде, насчитывающей миллиарды обычных клеток крови [8]. Все это делает проблему обнаружения ЦОК чрезвычайно сложной с методологической точки зрения. Одним из подходов, позволяющих подойти к решению трудной задачи выделения ЦОК, является фильтрационная технология. Известно, что по сравнению с клетками крови большинство ЦОК имеют больший размер (более 8 мкм, средний размер - 16 мкм). Это позволяет изолировать ЦОК, пропуская с помощью вакуума обработанную гемолитическим буферным раствором кровь через специальную мембрану с калиброванным порами размером 8 мкм - так называемая технология ISET [9, 10]. Методика показала высокую чувствительность, превосходящую показатели иммуномагнитной методики CellSearch, при изучении образцов крови пациентов c раком легкого, простаты, РМЖ [11-13]. С помощью данной технологии возможно изолировать большинство содержащихся в образце крови ЦОК и выполнить имму- но-молекулярную характеристику, включая определение экспрессии мезенхимальных маркеров (виментина), а также провести анализ мутаций в генах EGFR, KRAS, ALK и HER2 [14]. Важнейшим достоинством этой методики, с нашей точки зрения, является то, что факт наличия ЦОК устанавливает врач-цитолог, а дальнейшие иммуноцитохимические и молекулярно-генетические исследования являются важными, но не обязательными элементами исследования. В то же время такой подход неизбежно снижает специфичность метода, потенциально приводя к появлению ложноположительных результатов. Эта проблема не была решена в нашем исследовании: мы не можем исключить, что на мембранах могла содержаться примесь эпителиальных или эндотелиальных клеток неопухолевого происхождения. В связи с большим разнообразием методов детекции ЦОК клинические работы, посвященные их изучению, практически невозможно систематизировать и обобщить. Тем не менее необходимо отметить, что число исследований, посвященных клиническому значению ЦОК при РМЖ, велико. Так, по данным V.Mikulova и соавт. [15], у больных ранним РМЖ ЦОК определялись в 31% случаев, у 7% этих больных ЦОК сохранялись после адъювантной терапии. Не выявлено корреляции между ЦОК и размером опухоли, гистологическим типом и рецепторным статусом. Y.Lu и соавт. провели метаанализ выполненных исследований, включавших 642 пациентки с тройным негативным РМЖ, и сделали вывод о неблагоприятной прогностической роли детекции ЦОК в данной группе пациенток [16]. По данным Р.Р^аш и соавт., использовавших методику КЕТ, у больных с 1-ГУ стадией РМЖ ЦОК в периферическом кровотоке определялись в 27%. Наличие клеток подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Чувствительность и специфичность метода, по результатам авторов, сравнима с результатами полимеразной цепной реакции в реальном времени [17]. J.Gafforю и соавт. также показали неблагоприятное влияние ЦОК на продолжительность жизни пациенток с РМЖ, получавших химиотерапию. Кроме того, ими было установлено наличие корреляции между наличием ЦОК, экспрессией рецепторов к эстрогенам и статусом регионарных лимфатических узлов [18]. Рядом исследователей было установлено, что содержание ЦОК в периферической крови изменяется в зависимости от эффективности проводимой химио- или гормонотерапии. Так, по данным В5т№ и соавт. [19], ЦОК в периферической крови определялись более чем у 1/2 больных распространенным РМЖ, а их количество изменялось в зависимости от эффективности проводимой химио- или гормонотерапии (были изучены схемы СМД FEC, таксотер, тамоксифен, ана- строзол). Обнаружение ЦОК после химиотерапии коррелировало с уменьшением безрецидивной выживаемости и служило независимым фактором неблагоприятного прогноза [20]. Интересны исследования по определению ЦОК в крови больных операбельным РМЖ в процессе неоадъювантной химиотерапии. Наиболее крупные из них: GEPARQUINTO, GeparQuattro, REMAGUS02, Gunma Hospital, BEVERLY01, NEOAVA, NEoZoTAC, NEOALLTO [21]. Например, в исследовании GeparQuattro получены данные, свидетельствующие о том, что современные схемы химиотерапии не могут обеспечить полную элиминацию ЦОК у больных операбельным раком. Было продемонстрировано, что частота определения ЦОК после проведения неоадъювантной химиотерапии снижается с 22 до 11%. Также отмечено уменьшение количества клеток в 7,5 мл крови на фоне проводимой химиотерапии [22]. Другие авторы отмечают, что наиболее значимую прогностическую роль играет выявление ЦОК до проведения неоадъювантной химиотерапии [23]. В то же время пока не удается выявить корреляцию между динамикой ЦОК в процессе неоадъювантной химиотерапии и степенью патоморфологического ответа [21]. Нам удалось выявить ЦОК у 37% пациенток с РМЖ II-III стадии, что соответствует данным большинства исследователей. Лишь у 6 из этих 22 пациенток ЦОК сохранялись в кровотоке, несмотря на проводимую терапию. В то же время у 19 из 37 пациенток без ЦОК до начала лечения они были выявлены позднее в процессе терапии. Одним из интересных результатов нашей работы представляется выявленная статистически значимая корреляционная зависимость между исчезновением ЦОК после 2 первых циклов химиотерапии и последующим хорошим клиническим и патоморфологическим ответом на нее у пациентов с экспрессией Нег2-рецептора. Мы считаем, что в этой области необходимы дальнейшие исследования, которые позволят судить о клинической целесообразности, например, модификации терапии в данной группе пациенток при сохранении ЦОК в процессе лечения. Безусловно, иммуноцитохимическая и молекулярно-генетическая характеристика ЦОК, выявленных с помощью технологии ISET, имеет важное значение для определения биологического и прогностического значения обнаруженных клеток. Мы планируем проведение этих исследований в дальнейшей работе. В целом мы полагаем, что оценка динамики ЦОК в процессе лекарственного лечения пациенток РМЖ является перспективным направлением и требует дальнейшего изучения, в том числе в контексте раннего прогнозирования ответа на предоперационную терапию у пациенток с местно-распространенными формами заболевания.

About the authors

Yu N Nenakhova

Russian Medical Academy of Continuing Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: lyullikalya@mail.ru
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

V K Lyadov

Russian Medical Academy of Continuing Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

I V Poddubnaya

Russian Medical Academy of Continuing Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

References

Supplementary files