Radiological diagnostics of colorectal cancer liver metastases and immunohistochemical characteristics after drug treatment

Full Text

К олоректальный рак (КРР) занимает третье место по летальности среди онкологических заболеваний в мире [1]. В 2008 г. было диагностировано более 1,2 млн новых случаев. В некоторых странах смертность от КРР продолжает расти, например в азиатских странах, та- ких как Китай, Япония, Южная Корея, где заболеваемость за последние 20 лет выросла в 2-4 раза [2]. К сожалению, больше 1/2 больных КРР страдают различными формами метастатического поражения. Печень как орган-мишень наиболее часто подвержена такому негативному разви- тию заболевания. Резекция печени остается наиболее ре- альной радикальной лечебной опцией. Большинством онкологов признается невысокая возможность выполне- ния RO резекции печени - 10-30%. Логично понимание обстоятельства, что большая часть пациентов в качестве лечения получают различные режимы лекарственной те- рапии. Решение, к какой группе относится пациент, при- нимается на мультидисциплинарной комиссии с участи- ем химиотерапевта, хирурга-проктолога, хирурга-гепато- лога, лучевого диагноста. Периоперационная химиотерапия с использованием оксалиплатина или иринотекана доказала свою эффек- тивность в лечении пациентов с КРР. Недавно в лечении метастатического КРР (мКРР) появилась возможность применения таргетных препаратов, представляющих со- бой моноклональные антитела к различным факторам роста. К настоящему времени в клинической онкологии накоплен уже большой лечебный опыт в рамках конвер- сионной терапии. Такие препараты, как цетуксимаб и па- нитумумаб, для которых предиктивным маркером эффек- тивности служит «дикий» тип KRAS, направлены против эпидермального фактора роста. Для понимания механиз- мов противоопухолевого действия таргетных анти-VEGF- препаратов на факторы апоптоза в метастатических оча- гах КРР необходимы такие же исследования, как и при опухолях другой локализации. Решение всех тактических вопросов лечения КРР напря- мую зависит от уровня и качества результатов методов луче- вой диагностики (магнитно-резонансная томография - МРТ, мультиспиральная компьютерная томография - МСКТ). Не- смотря на диагностические успехи, сохраняются сложности интерпретации данных как при первичной диагностике, так и в случаях после проведенной химиотерапии или прогрес- сии заболевания. Достаточно часто в практической медицине имеют место как ложноотрицательные, так и ложнополо- жительные результаты проведенной диагностики. Цель настоящего исследования - оценить значи- мость диагностических и иммуногистохимических ха- рактеристик после лекарственной терапии в условиях хи- рургического стационара. Материалы и методы В анализ включены 59 пациентов с мКРР печени с проспективным набором в период с января 2010 г. по апрель 2014 г. Средний возраст составил 57±10,2 года. Распределе- ние по полу: мужчины - 50,8% (n=30), женщины - 49,2% (n=29). Первичная опухоль локализовалась в прямой кишке у 32,2% (n=19) и ободочной кишке у 67,8% (n=40). Синхрон- ность метастазирования имела место у 78% (n=46), а спустя 3 мес после первичной операции - у 22% (n=13), что было квалифицировано как метахронное появление очагов. Ин- декс массы тела варьировал от 19,5 до 38,6 со средним значением 25,3±3,8. Солитарные метастазы имели место у 21 (35,6%) больного: по 2-3 очага у 21 (35,6%) и более 3 ме- тастазов у 17 (28,8%). Локализация очагов была следующая: правая половина печени - 26 (44%) человек, левая полови- на - 10 (17%) и билобарное поражение - 23 (39%). В каче- стве конверсионной терапии были использованы режимы FOLFOX (81,4%) и FOLFIRI (8,5%), дополненные таргетными препаратами (44%): бевацизумаб (n=14), панитумумаб (n=9) и цетуксимаб (n=3). Количество полученных курсов составило 5,8±2,1 (от 2 до 12) при медиане 6. С диагностической целью всем пациентам перед хи- миотерапией и после нее выполняли МРТ и/или МСКТ. Визуализационные КТ-МР-характеристики очагов печени включали количество, размер, локализацию, денситомет- рические параметры. Эффективность лекарственной те- рапии оценивали с помощью критериев RECIST и у селек- тивной группы пациентов фиксировали толщину «погра- ничного» слоя [3, 4]. Нами дополнительно проведено иммуногистохимиче- ское исследование на операционном материале метаста- зов в печени. В анализ вошли 14 больных (мужчин - 7, женщин - 7; возраст от 46 до 75 лет, медиана возраста - 57 лет), которым проводили комбинированную цитоток- сическую и таргетную анти-VEGF-терапию в качестве 1-й линии. Группу сравнения составили 35 пациентов с метастазами в печени (мужчин было 20, женщин - 15; возраст - от 39 до 71 года, медиана возраста - 59 лет), ко- торым химиотерапию не проводили. Иммуногистохими- ческое исследование выполняли в иммуногистостейнере Bond-Max (Leica) в автоматическом режиме. Использова- ли следующие первичные антитела: к PML (Santa Cruz Biotechnology, клон PG-M3; разведение 1:100), Bax (Santa Cruz Biotechnology, клон B-9; разведение 1:150) и Bcl-2 (Dako, клон 124; разведение 1:200). Интенсивность окрашивания при иммунопероксидаз- ной реакции оценивали полуколичественным методом при световой микроскопии. Для визуализации изображе- ния использовали цифровую камеру (Leica). Анализ данных проведен с использованием пакета ста- тистических программ Statistica 8.0. В описательной ста- тистике в связи с асимметричным распределением пере- менных использованы среднее значение, медиана и раз- мах (min-max). Сравнение количественных признаков проведено при помощи критерия Манна-Уитни, каче- ственных признаков - при помощи критерия χ2 или точного критерия Фишера (при количестве наблюдений в группе менее 5). Различия между группами считали стати- стически значимыми при p<0,05. Результаты исследования МСКТ перед химиотерапией (n=41) позволила обнаружить 103 метастаза КРР в печень. По нашим данным, раз- меры очагов в этой серии пациентов составили 34±29 мм (от 4 до 175 мм) при медиане 26 мм. Визуализированные очаги в печени характеризовались более низкой плот- ностью, чем сама паренхима печени (подавляющее число метастазов имели плотность 30-48 HU, создавая неодно- родность структуры). Наиболее специфическим лучевым признаком метастазов КРР в печени было присутствие ги- поваскулярных образований с более отчетливой иденти- фикацией их в венозную фазу за счет появления и визуа- лизацией слабого периферического кольцевидного конт- растирования. В большинстве наблюдений (при среднем индексе массы тела) плотность паренхимы печени перед началом лекарственной терапии равнялась классическим значениям - 50-70 HU. МРТ до предоперационной терапии (n=16) дала воз- можность диагностировать 63 метастаза. По нашим дан- ным, средний размер выявленных образований составил 19,9±15,9 мм (от 4 до 83 мм) при медиане 15 мм. Метаста- зы КРР имели гипоинтенсивный МР-сигнал, который был ниже, чем у паренхимы печени на нативных Т1-ВИ и Т1(FS)-ВИ и несколько выше (гиперинтенсивный) на изо- тропных DWI-BИ, Т2-ВИ и Т2(FS)-ВИ. При очагах более 50 мм наблюдали периферический инфильтративный ободок из-за опухолевой компрессии на печеночные клетки, что исключало доброкачественную природу забо- левания. Контрастирование метастазов показывало низ- кий уровень накопления, а при крупных образованиях ча- сто визуализировались как гетерогенные без накопления центральной зоны. В случаях подозрения на мелкие очаги (<10 мм) использование гадоксетовой кислоты (n=6) поз- волило выполнить точную диагностику. По результатам МСКТ у 38 пациентов после химиотера- пии и принятия решения вопроса об оперативном вме- шательстве нами было диагностировано 83 метастаза (рис. 1). У 31 больного данное исследование производи- лось до и после химиотерапии. Средний диаметр обнару- женных очагов составил 31±28,3 мм (от 4 до 150 мм) при медиане 20 мм. Вследствие химиотерапии происходило уменьшение размеров и плотности метастазов, но коли- чественно эта разница не была достоверна. В целом контрастные характеристики очагов концептуально не менялись, но вместе с тем в артериальную фазу они ста- новились более васкуляризированными. Нами было от- мечено появление выраженной неоднородности очагов после лекарственной терапии, но такой феномен чаще характеризовал более крупные метастазы. Крайней сте- пенью патоморфоза опухоли по причине лекарственно- го влияния рассматривали визуализацию кальцинатов, что отметили у 10 пациентов. Рис. 1. МСКТ мКРР: а - до лекарственной терапии бевацизума- бом, б - после лекарственной терапии бевацизумабом. Рис. 2. МРТ: а - до лекарственной терапии, б - после лекарст- венной терапии. Рис. 3. Изменение структуры метастаза после химиотерапии - уве- личение зоны некроза: а - исходный вид, б - после химиотерапии. Всего 79 метастазов были визуализированы с помощью МРТ после химиотерапии у 23 пациентов (рис. 2). Сред- ний диаметр очагов в результате исследования равнялся 17±13,6 мм (от 3 до 80 мм), а медиана - 13 мм. Показатели интенсивности сигнала на МР-изображении от метаста- зов в этой группе кардинально не отличались от предыду- щих значений. Как и при использовании МСКТ, после те- рапии обращало внимание усиление контрастирования очагов в артериальную фазу. Дополнительное использо- вание диффузионно-взвешенного изображения - diffu- sion weighted imaging, DWI (b=50,400,800 c/mm2) изобра- жений для уточнения мелких образований менее 10 мм в диаметре в совокупности с гадоксетовой кислотой у 9 па- циентов характеризовалось слабым гиперинтенсивным МР-сигналом. Лекарственная терапия дала возможность получить нам весьма обнадеживающие результаты лечения у 95% боль- ных. Так, стабилизация очагов получена у 26 (44%) больных, регресс метастазов был достигнут у 29 (49,2%) и полный от- вет констатировали в одном наблюдении (1,7%). К сожалению, у 3 (5%) пациентов отметили прогрессию за- болевания, несмотря на проводимую терапию. Наличие «пограничного» слоя как визуализационного феномена (МСКТ/МРТ) после лечения было обнаружено у 7 (11,9%) пациентов (рис. 3). Это явление объяснялось хорошо выра- женным патоморфозом в опухолевой ткани и было харак- терно для метастазов среднего и крупного диаметров (>50 мм). Тенденция в сторону уменьшения величины «по- граничного» слоя - потенциально благоприятное прогно- стическое явление. Негативное цитотоксическое воздей- ствие химиопрепаратов на гепатоциты и печеночные триа- ды реализовалось в развитии жирового гепатоза, преиму- щественно иринотекана (n=3) и «голубой» печени как след- ствие синусоидальной дилатации (в основном после окса- Рис. 4. Макропрепараты удаленной печени: а - развитие жирового гепатоза после лекарственной терапии, б - развитие «голубой» печени после лекарственной терапии; в - на КТ жировой гепатоз после химиотерапии. Рис. 5. Экспрессия PML, Bax и Bcl-2 в метастазах КРР в печени, иммуногистохимическая окраска: а - экспрессия PML при тера- пии бевацизумабом, ×200; б - сниженная экспрессия Bax у па- циента из контрольной группы, ×200; в - повышенная экспрес- сия Bax после лечения бевацизумабом, ×200; г - повышенная экспрессия Bcl-2 у пациента из контрольной группы, ×200. липлатина); n=14 (рис. 4). При МСКТ жировой гепатоз про- являлся существенным снижением плотности паренхимы. Такое эффективное лекарственное лечение способ- ствовало выполнению одно- или двухэтапных операций у всех пациентов данной группы. Это дало возможность максимально достоверно проверить предоперационные визуализационные параметры МСКТ/МРТ. Дооперацион- ные данные всей группы больных сопоставляли с резуль- татами интраоперационной ревизии (включая данные УЗИ) и изучения макропрепаратов. В итоге у 13 (22%) больных имело место несовпадение предоперационных и экспертных данных. Ложноположительные результаты были получены у 5 пациентов, когда лучевой диагност трактовал дополнительные очаги, реально отсутствовав- шие. Ложноотрицательные результаты получились у 8 па- циентов, когда реальные очаги были пропущены на момент оценки изображений. Во всех этих случаях средние размеры просмотренных или гипердиагностированных очагов были менее 10 мм, исключение составил один ме- тастаз диаметром 16 мм. Главным итогом анализа данных лучевой диагностики метастазов КРР у этой категории больных явилась оценка чувствительности МСКТ и МРТ, которая составила, соответственно, 85 и 89%. По итогам иммуногистохимического исследования экс- прессии PML в метастазах КРР в печени обнаружено, что у большинства пациентов контрольной группы данный маркер не определялся (69%). Применение таргетной ан- ти-VEGF-терапии привело к уменьшению количества та- ких случаев до 29% (рис. 5, а). Наличие PML выявлено у 31% пациентов из группы сравнения и у 71% больных, получав- ших бевацизумаб (см. таблицу). Как следствие, при тера- пии бевацизумабом достоверно чаще выявляли положи- тельную экспрессию PML по сравнению с группой конт- роля (р=0,01). Иммуногистохимическое изучение индук- тора апоптоза Bax показало, что его сниженное содержа- ние отмечалось у 71% больных, получавших анти-VEGF- терапию, и у 69% пациентов из группы контроля (рис. 5, б). Повышенная экспрессия Bax отмечалась, соответственно, у 29% пациентов, получавших сочетанную терапию, и у 31% пациентов из сравнительной группы (см. таблицу, рис. 5, в). В группе нелеченных пациентов в 9% случаев экспрессия отсутствовала, в то же время после предопера- ционной комбинированной терапии с таргетным анти- VEGF-препаратом не отмечали случаев отсутствия данно- го маркера. Сопоставление содержания проапоптотиче- ского белка Bax в группе пациентов, получавших предопе- рационную терапию бевацизумабом, с пациентами без те- рапии достоверных отличий не выявило (р=0,5). Анализ экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 выявил его сниженную экспрессию у большинства паци- ентов, получивших химиотерапевтическое лечение (79%), в то время как в контрольной группе выявлено сопостави- мое число пациентов со сниженной и повышенной экс- прессией данного маркера (54 и 46% соответственно); см. таблицу, рис. 5, г. Сравнительный анализ содержания данного маркера после проведения терапии бевацизума- бом с контрольной группой достоверных отличий не об- наружил (р=0,1). Экспрессия PML, Bax, Bcl-2 в метастазах КРР в печени Маркер Выраженность экспрессии Группа больных, получивших лечение цитотокси- ческими и таргетным анти-VEGF-препаратами Контрольная группа Число пациентов абс. % абс. % PML - 4 29 24 69 + 10 71 12 31 Bax - 10 71 24 69 + 4 29 11 31 Bcl-2 - 11 79 19 54 + 3 21 16 46 Примечание. Экспрессия Bax и Bcl-2: «-» - сниженная, «+» - повышенная; экспрессия PML: «-» - отсутствие иммунопероксидазного окрашива- ния; «+» - окрашивание более 10% ядер опухолевых клеток. Комментарии к результатам Проблема мКРР на сегодняшний день приобрела комплексный характер, выйдя за пределы поля зрения химио- терапевтов и вовлекая специалистов хирургических на- правлений (хирургов-гепатологов, торакальных хирур- гов, нейрохирургов и т.д.). Алгоритм ведения и наблюде- ния таких пациентов усложняется по мере задействова- ния все большего числа врачей, что требует выработки четких рекомендаций. Решение любых тактических вопросов кардинально за- висит от качества диагностических исследований. Совре- менные возможности лучевой диагностики (МСКТ, МРТ) расширили диапазон для планирования лечения. Доопе- рационная диагностика метастазов печени колоректаль- ной этиологии к настоящему времени в специализирован- ных учреждениях не представляет больших сложностей при размерах очагов более 1 см. В большинстве случаев точности МСКТ достаточно для выявления метастазов, од- нако при трудностях дифференциальной диагностики ис- пользование МРТ оправданно, особенно при очагах мало- го диаметра. По нашим данным, определение чувствитель- ности МСКТ и МРТ показало высокие и сопоставимые ре- зультаты (85 и 89% соответственно), которые сравнимы с показателями недавних исследований [5]. С увеличением интереса разных специалистов к проблеме мКРР особое значение приобретает лучевая диагностика у пациентов после лекарственной химиотерапии, которая изменяет характеристики самих очагов и паренхимы печени. Со- временным трендом у этой группы больных является воз- растание роли МРТ, что повышает возможности диагно- стики метастазов небольшого диаметра [6]. Использова- ние гадоксетовой кислоты существенно расширило диаг- ностические возможности метастатического поражения печени [7]. По нашим данным, ложноотрицательные ре- зультаты преобладали, что вполне логично из-за малых размеров очагов и структурных изменений паренхимы печени после химиотерапии. Несмотря на отсутствие признаков регресса по критериям RECIST, у нескольких больных при стабилизации процесса лекарственная тера- пия расценена как эффективная за счет патоморфоза в центре опухоли. Лучевая и морфологическая оценка «по- граничного» слоя метастаза рассматривается перспектив- ным направлением для дальнейших исследований. Успехи лекарственной терапии мКРР на сегодняшний день очевидны. Добавление таргетных препаратов к базо- вым режимам химиотерапии существенно увеличило эф- фективность лечения. По данным LiverMetSurvey.org, к концу 2013 г. в международной базе зарегистрированы результаты лечения 22 тыс. хирургических пациентов. Среди пациентов, получавших предоперационную хи- миотерапию в комбинации с таргетными препаратами, большинство из них лечились бевацизумабом (после 1-й линии химиотерапии FOLFOX/FOLFIRI + бевацизумаб - 631/532). Добавление бевацизумаба к FOLFOX сопровож- дается достоверным повышением частоты полного или выраженного ответа у пациентов, подвергшихся резек- ции печени после неоадъювантной химиотерапии [8]. В нашем исследовании введение в предоперационную те- рапию бевацизумаба также ассоциировалось с повыше- нием показателя контроля над заболеванием и достовер- ным уменьшением риска прогрессирования на фоне хи- миотерапии по сравнению с другими схемами лечения. Практически все наши пациенты получали бевацизумаб в сочетании со схемами на основе оксалиплатина. При сравнении с подгруппой пролеченных схемами на осно- ве оксалиплатина без бевацизумаба достоверность разли- чий исчезала, однако сохранялась отчетливая тенденция в пользу добавления бевацизумаба. Возможно, утрата до- стоверности обусловлена недостаточной статистической силой числа пациентов в обеих группах. Таким образом, на основании полученных нами данных можно сказать, что предоперационная терапия на основе оксалиплатина и бевацизумаба является одной из важных опций дости- жения контроля над заболеванием, что чрезвычайно важ- но, учитывая ухудшение отдаленных результатов резек- ции печени на фоне прогрессирования опухолевого про- цесса [9]. В настоящее время практически не изучено влияние таргетных анти-VEGF-препаратов на факторы апоптоза в метастатических очагах КРР, хотя апоптоз является одним из основных механизмов их противоопухолевого дей- ствия. Представленные в литературе работы посвящены изучению апоптоза под действием этих препаратов в экс- периментальных работах [10] либо при опухолях других локализаций [11, 12]. В нашем исследовании применение предоперационной анти-VEGF-терапии привело к более частой положительной экспрессии PML, участвующего в индукции апоптоза. Нами не выявлено изменения экс- прессии проапоптотического белка Bax после терапии бевацизумабом, но при этом отмечено снижение содер- жания ингибитора апоптоза Bcl-2 (разница статистиче- ски недостоверна, возможно, из-за малочисленности группы пациентов, получавших анти-VEGF-терапию). На основании полученных данных можно сделать вывод, что бевацизумаб индуцирует процесс апоптоза опухоле- вых клеток в метастазах КРР, увеличивая содержание ин- дуктора апоптоза PML и снижая - ингибитора Bcl-2. Даль- нейшие исследования механизмов элиминации опухоле- вых клеток путем апоптоза под действием таргетных ан- ти-VEGF-препаратов позволят объяснить степень их эф- фективности и выявить маркеры для определения чув- ствительности к данным препаратам. Таким образом, проблема мКРР остается крайне акту- альной. К сожалению, резектабельность метастазов в печени остается невысокой, поэтому большая часть боль- ных получает лекарственную терапию. С учетом реаль- ных успехов химиотерапии в сочетании с таргетными препаратами доля хирургических больных увеличивает- ся. В мультидисциплинарной стратегии большую роль иг- рают лучевая диагностика и современные иммуногисто- химические исследования.

About the authors

T O Skipenko

E M Paltseva

M I Sekacheva

A L Bedganian

References

Supplementary files