Morfoimmunologicheskaya kharakteristika porazheniya kostnogo mozga pri diffuznoy V-kletochnoy krupnokletochnoy limfome

Full Text

Введение Диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома (ДВКЛ) составляет около 40% всех вариантов НХЛ и является наиболее часто встречающейся лимфоидной опухолью взрослых в развитых странах Запада и в России [1]. Возрастная медиана приходится на 60-70 лет, однако разброс очень велик и значительное число случаев приходится на молодой и детский возраст. Этиология ДВКЛ остается неясной. Чаще всего очаг лимфомного роста возникает de novo, существенно реже - вследствие феномена прогрессии/трансформации предсуществующих индолентных мелкоклеточных вариантов В-НХЛ. Вероятность возникновения ДВКЛ значительно повышается при иммунодефицитах различной этиологии, в первую очередь на фоне ВИЧ-инфекции или иммуносупрессивной терапии. Обсуждается роль вирусов типа Эпштейна-Барр и герпес-вируса человека 8-го типа (HHV-8) [1, 2]. Преобладающим считается нодальный дебют заболевания, однако примерно в 40% случаев первичный опухолевый очаг ДВКЛ может возникать экстранодально во всех органах и системах с преимущественным поражением пищеварительного тракта. Описаны достоверные различия в клиническом течении между первичными нодальными и экстранодальными формами ДВКЛ, а также разными органными локализациями экстранодальных вариантов [3-5]. Субстрат ДВКЛ представляет собой диффузный пролиферат крупных неопластических лимфоидных клеток характерного облика с бластной структурой хроматина, экспрессирующих маркеры В-линейной дифференцировки в сочетании с антигенами клеток периферических (посткостномозговых) этапов В-лимфопоэза [1]. ДВКЛ отличается агрессивным клиническим течением и высокой чувствительностью к режимам полихимиотерапии, включающим препараты антрациклинового ряда. Нестабильность клинических показателей эффективности терапии при общей высокой химиочувствительности опухоли (5-летняя выживаемость, по разным данным, не превышает 50%, и основные причины смерти связаны с прогрессией болезни) определяет повышенный интерес клиницистов и патологов к поиску наиболее значимых факторов клинической гетерогенности ДВКЛ. Основная прогностическая модель -международный прогностический индекс (International Prognostic Index - IPI) - базируется на клинических параметрах, эффективна только для разделения пациентов на группы с разной вероятностью рецидива после проведения стандартной терапии и не проливает свет на биологические различия между ними [6]. Существующая субклассификация морфологического уровня, включающая деление на 5 основных подтипов в зависимости от преобладания клеточных форм - центробластный, иммунобластный, анапластический, плазмобластный, а также вариант, богатый Т-клетками, выглядела наиболее наглядной и воспроизводимой, однако связь с клиническим течением и прогностическое значение для разных типов оказались неоднозначными и продолжают обсуждаться [7]. Комплексное изучение иммунофенотипа нозологии, профиля экспрессии генов и сравнения результатов с параметрами in vitro В-клеток нормального лимфопоэза позволили выделить два основных подтипа ДВКЛ и ассоциированные с ними факторы прогноза: вариант, несущий черты клетки зародышевого центра [CD10+/-, Bcl-6+, Bcl-2+/-t(14;18)+/-] и вариант - аналог этапа периферической активированной В-клетки [CD10-, Bcl-6+/-, Bcl-2+/-, CD138+/-, MUM-1+ t(14;18)] [4, 8-12]. В некоторых исследованиях дополнительно выделяется и третий вариант, без уточненных молекулярных характеристик [13]. Более углубленный анализ профиля генной экспрессии позволяет говорить о предположительной градации ДВКЛ уже по принципу преимущественного повреждения сигнальных путей, приводящих к неопластической трансформации клетки и выделении на этом основании мишеней для молекулярной и иммунной таргетной терапии, например NF-κB, Bcl-6 и др. [14, 15]. Описаны следующие три типа: • "Ox Phos" ("окислительного фосфорилирования") - отличается повышенной экспрессией генов, ответственных за антиопоптоз, митохондриальные функции и т.д.; • "B-cell receptor/proliferation - BCR" ("В-клеточный рецептор/пролиферация") - характеризуется экспрессией генов-регуляторов клеточного цикла, компонентов сигнального каскада, опосредуемого В-клеточным рецептором, и т.д.; • "host response - HR" ("ответ хозяина") - выделяется в отличие от первых двух не столько на основе экспрессии генов опухолевых клеток, сколько на основе генов, ответственных за иммунный ответ хозяина, опосредуемого Т-клеточным рецептором, путей активации Т- и NK-клеток, компонентов комплемента, молекул адгезии и т.д. Настоящее исследование посвящено особенностям поражения костного мозга при ДВКЛ. Вовлечение костного мозга происходит примерно в 15-30% случаев и относится к неблагоприятным клиническим факторам прогноза [3, 16]. В качестве одного из основных патогенетических факторов костно-мозгового метастазирования ДВКЛ рассматривается экспрессия молекул адгезии клетками опухоли. Так, например, высокий уровень растворимой формы молекулы суперсемейства иммуноглобулинов (sICAM-1/sCD54) ассоциируется с высоким риском диссеминации лимфомы, в то время как низкая экспрессия ее же цитоплазматической формы клетками опухоли - с более благоприятным течением [17]. Интересен тот факт, что в соответствии с молекулярной градацией ДВКЛ на основании профиля генной экспрессии усиление сигнала от генов, кодирующих молекулы адгезии, в том числе ICAM-1, наблюдается в группе ДВКЛ «host response», характеризующейся наиболее частым поражением костного мозга у больных [15, 18]. Метастазирование ДВКЛ в костный мозг может быть заподозрено на основании клинических данных и уточнено с помощью лучевых и радиоизотопных методов. Одним из наиболее информативных методов установления поражения костного мозга при ДВКЛ является позитронная эмиссионная томография (ПЭТ), однако исследование достаточно часто дает ложнопозитивные результаты [19]. Объективное подтверждение и соответственно рестадирование процесса может быть проведено только при морфологическом или морфоиммунологическом исследовании костного мозга, причем с наибольшей частотой поражение определяется при гистологическом исследовании материала трепанобиоптата костного мозга [2, 19-21]. В аспирате костного мозга патологический лимфоцитоз (бластоз), как правило, проявляется только по мере экспансии костно-мозгового клона. Примерно в 20% случаев при ДВКЛ встречается гистологическая дискордантность между костно-мозговым субстратом лимфомы и субстратами других локализаций. В современной литературе явление дискордантных гистологических ситуаций при ДВКЛ обсуждается недостаточно. Суммируя опубликованный материал, можно определить основные причины дискордантности, выделяемые зарубежными коллегами: • Трансформация индолентной В-НХЛ (наиболее характерно для В-ХЛЛ - синдром Рихтера). Представляет собой явление опухолевой прогрессии [20, 21]. • Реактивный процесс. Мелкоклеточные инфильтраты в костном мозге в противопоставление экстрамедуллярной В-клеточной крупноклеточной лимфоме имеют Т-клеточную природу с разным преобладанием CD4+ или CD8+ популяций [22]. • Истинная биклональность. Одновременное сосуществование двух лимфопролиферативных процессов с разными иммуноморфологическими и молекулярно-биологическими клональными особенностями [23]. Материалы и методы Нами был проанализирован ретроспективный и проспективный материал 24 больных ДВКЛ, проходивших обследование и лечение амбулаторно в гематологическом кабинете поликлиники или стационарно в отделении химиотерапии гемобластозов НИИ КО ГУ РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. Основой для включения больных в исследование было выявление в костном мозге (в трепанобиоптатах и/или аспиратах) лимфоидной любого типа, подозрительной в отношении поражения. Соотношение по полу составило 0,7 с преобладанием лиц женского пола, средний возраст 50 лет. Характеристика экстрамедуллярного компонента Комплексное иммуноморфологическое исследование экстрамедуллярного субстрата лимфомы было проведено в 21 случае. В 3 наблюдениях биопсия не проводилась по разным причинам: в наблюдении больной А., 28 лет, имел место диссеминированный процесс с изолированным поражением костей/костного мозга, в двух других случаях (больная Б., 66 лет, и пациент М., 47 лет) особенностью локализации лимфомы было преимущественное поражение забрюшинных лимфатических узлов, тяжелый соматический статус больных послужил противопоказанием для проведения биопсии: иммуноморфологическому исследованию с применением иммунофлюоресцентного метода была подвергнута асцитическая жидкость и материал тонкоигольной биопсии. У 14 (58%) пациентов имела место первичная нодальная локализация лимфомного субстрата, в остальных 10 (42%) - экстранодальная. Диагноз ДВКЛ в рамках современной классификации ВОЗ (2001 г.) устанавливали на основании комплексного иммуноморфологического исследования доступного биопсийного материала больных. Основой первичной диагностики служило иммуноморфологическое исследование экстрамедуллярного компонента (при его наличии), полученного путем хирургической биопсии. Фиксацию и заливку в парафин биопсийного материала проводили по принятым в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН стандартным протоколам. Гистологическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков, окрашенных гематоксилином и эозином, а также дополнительно (в зависимости от типа ткани) по Браше и пикрофуксином. Гистологические признаки диагноза ДВКЛ соответствовали предложенным в классификации ВОЗ (2001 г.). Во всех случаях (в лимфатических узлах - со стиранием рисунка строения, при экстранодальных локализациях - гистологической структуры органа) обнаруживался диффузный инфильтрат из крупных клеток с выраженным ядерным плеоморфизмом, нежной структурой хроматина, а также видимыми одним или нескольким ядрышками. Абсолютное большинство случаев относилось к центробластному варианту, также имели место иммунобластный и анапластический. Иммунофенотипирование опухолевой ткани в 16 (76%) случаях из 21 проводили на свежезамороженных (криостатных) срезах биопсийного материала (фиксация в ацетоне) в лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН со стандартной панелью моноклональных антител. При отсутствии свежего биопсиийного материала для типирования срезов в оставшихся 5 (24%) был применен иммуноферментный метод (иммуногистохимия) на срезах с парафиновых блоков в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Критериями иммунологического диагноза в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2001 г.) было обнаружение экспрессии опухолевыми клетками пан-В-клеточных маркеров, маркеров зрелых этапов дифференцировки В-клеток (иммуноглобулины, CD37) при отсутствии маркеров специфических вариантов В-клеточных лимфом, молекул другой линейной принадлежности и маркеров клеток-предшественников [1, 24]. Характеристика аспирата костного мозга Морфология Аспират костного мозга получали путем пункции тела или рукоятки грудины, а также задних остей подвздошных костей. Для исключения разбавления периферической кровью брали небольшой объем костного мозга (0,5-1,0 мл) в пробирки с ЭДТА. Иммунологическое (проточная цитометрия) и цитологическое (миелограмма) исследования в лаборатории иммунологии гемопоэза проводили из одной и той же пробирки с обязательным подсчетом клеточности и количества мегакариоцитов в 1 мкл костного мозга. Цитологическое исследование проводили на мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимзы, с предварительной фиксацией в 96% метаноле. Иммунофенотипирование аспиратов Иммунофенотипирование материала аспиратов костного мозга было проведено в 8 случаях. Иммунофенотип изучали методом проточной цитофлюориметрии на приборе "FACScan" с двух- и трехцветным флюоресцентным мечением при использовании прямых конъюгатов моноклональных антител с флюорохромами типа FITC (флюоресцеин-изотиоциант), PE (фикоэритрин) и PЕ/Су5 (перидинин-хлорофилл). Основанием иммунологического подтверждения лейкемизации ДВКЛ было выделение клеток по параметрам светорассеивания в сочетании с экспрессией В-клеточных антигенов. Фенотип периферических этапов лимфоидной дифференцировки для опухолевых бластов определяло, как уже говорилось, сочетание экспрессии пан-В-клеточных антигенов (CD19 и CD20) с молекулой CD37 при отсутствии экспрессии маркера клеток-предшественников CD34, а также линейная рестрикция по одной из легких цепей иммуноглобулинов к или л. Из 3 случаев зрелоклеточного лимфоцитоза иммунофенотипирование аспирата костного мозга методом проточной цитофлюориметрии было проведено только в одном случае (больной Ш., 58 лет). Признаков лейкемизации периферической В-клеточной лимфомы обнаружено не было, 76% лимфоцитов составили активированные (HLA-DR+, CD1a+) Т-клетки, среди которых преобладала цитотоксическая CD8+ субпопуляция. В 2 других случаях иммунофенотип лимфоидного компонента был оценен при проведении иммуногистохимического исследования трепанобиоптатов костного мозга. Исследование трепанобиотатов костного мозга Морфология При морфологическом исследовании трепанобиоптатов костного мозга в 9 случаях определялся субстрат ДВКЛ, схожий по морфологическим характеристикам с экстрамедуллярным опухолевым компонентом (в одном случае с бластным компонентом в миелограмме трепанобиоптат не исследовался). Гистологический тип поражения костного мозга в этих случаях был диффузным, с практически тотальным замещением нормальной гемопоэтической ткани. Рост лимфомы сопровождался вторичными изменениями в виде некроза, коллагенового склероза. Проведено сопоставление миелограммы и гистологической картины трепанобиоптатов костного мозга большинства случаев с наличием бластов в миелограмме. У 14 больных на гистологическом уровне была отмечена дискордантность между экстрамедуллярным и костно-мозговым субстратами. В одном случае (больной Ш., 58 лет) гистологически поражение костного мозга обнаружено не было, в наблюдении больной П., 52 лет, с высоким бластозом в аспирате костного мозга гистологическое исследование костного мозга не проводилось. В 9 случаях из 14 в трепанобиоптатах определялась исключительно мелкоклеточная лимфоидная инфильтрация, представленная скоплениями лимфоидных клеток с нечеткими контурами, расположенными в гемопоэтической ткани центра межбалочных полостей. Во всех случаях клетки имели некоторую схожесть с центроцитоидными по причине "угловатой" формы ядер. В 5 случаях из 14 лимфоидные скопления имели смешанный характер: среди мелкоклеточного компонента, составлявшего основную часть инфильтрата, определялась некоторая часть разрозненных крупных клеток с бластной структурой хроматина и ядерным плеоморфизмом, напоминавших клетки основного (экстрамедуллярного) лимфомного субстрата лимфомы. В 3 случаях из 5 инфильтраты имели сочетанную меж- и паратрабекулярную локализацию. Иммунофенотипирование трепанобиоптатов костного мозга Иммунофенотипирование материала трепанобиоптатов было проведено в 18 случаях на депарафинированных срезах в сочетании иммунофлюоресцентного и иммуноферментного методов, разработанном авторами в лаборатории иммунологии гемопоэза. Иммунофенотипирование проведено в 5 случаях с диффузной бластной инфильтрацией, в 8- с лимфоцитарной и в 5- со смешанно-клеточной. Во всех случаях бластной инфильтрации было подтверждено поражение при ДВКЛ. В 2 случаях (больная А., 28 лет, с первично-множественным поражением костей/костного мозга и пациентка Б., 66 лет, с тяжелым соматическим статусом) субстрат лимфомы в материале трепанобиоптата был единственно доступным для диагностических манипуляций. Диагноз ДВКЛ был установлен на основании типичной морфологической картины, экспрессии пан-В-клеточного антигена CD20, при отсутствии экспрессии молекулы клеток-предшественников CD34, антигена CD30, а также маркеров других линейных направленностей. У 8 пациентов с исключительно мелкоклеточной лимфоидной инфильтрацией костного мозга все скопления оказались мономорфно экспрессировавшими Т-линейные антигены СD3 и CD45RO. В-клетки во всех случаях выглядели малочисленными без признаков атипии. В 5 случаях со смешанным клеточным составом (центроцитоидно-центробластного типа) при экспрессии основным мелкоклеточным лимфоидным компонентом Т-линейных маркеров дискретные анаплазированные бластные клетки экспрессировали пан-В-клеточный антиген СD20 при отсутствии CD30, CD34, CD15. Обсуждение Таким образом, у 24 пациентов с ДВКЛ мы наблюдали 3 основных типа морфологических изменений в костном мозге: бластную инфильтрацию (10), иммуноморфологически идентичную первичному экстранодальному субстрату, и 2 типа дискордантных лимфоидных инфильтратов - смешанный лимфоцитарно-бластный (5) и чистый лимфоцитарный (9). Бластный тип поражения не вызывал диагностических затруднений. Бластный компонент определялся в материале аспирата и трепанобиоптата костного мозга, во всех случаях полностью морфоиммунологически соответствовал экстрамедуллярному компоненту. При сопоставлении морфологического исследования аспирата и трепанобиоптата костного мозга, при относительно невысоком уровне патологических бластов аспирата (медиана - 10%), при гистологическом исследовании трепанобиоптатов тех же больных определялось субтотальное замещение нормальной гемопоэтической ткани субстратом опухоли. Исходя из сопоставления собственных результатов с данными литературы, можно высказать предположение, что основу феномена составляют биологические особенности лимфомы, определяющие не интерстициальную, "поклеточную" диссеминацию лимфомы, а мультифокальный, саркомоподобный ее рост, принципиально отличающийся от диффузного интерстициального ("смешанного" с нормальным гемопоэзом) типа при мелкоклеточных В-клеточных лимфомах с высоким риском лейкемизации, например В-клеточном хроническом лимфолейкозе/лимфоме из малых лимфоцитов. Иммуногистохимически показано, что количество Т-клеток (CD3+; CD45RO+) при диффузном бластном типе поражения костного мозга было минимальным. Т-лимфоциты были представлены единичными разрозненными формами, располагавшимися в основном в пределах зон лимфомного роста (интратуморально), без тенденции к образованию интерстициальных скоплений. В подгруппе с чистым мелкоклеточным лимфоцитарным типом инфильтрации (9) абсолютное большинство мелких лимфоидных клеток было представлено реактивными Т-лимфоцитами (CD3+, CD45RO+). В-клетки (CD20+) были единичными и не несли цитологических признаков атипии. Следует отметить, что мелкоклеточная лимфоидная инфильтрация в подавляющем числе наблюдений была определена только при исследовании трепанобиоптатов костного мозга, при этом иммуногистохимическое исследование на основании исключения поражения при ДВКЛ позволило правильно стадировать процесс. При смешанном типе лимфоидной инфильтрации (5) иммуногистохимическое исследование костного мозга тоже оказалось решающим для стадирования - лимфоидная инфильтрация обнаруживалась только при анализе трепанобиоптатов. Мелкоклеточный лимфоидный компонент нес маркеры Т-клеток (CD3+, CD45RO+), а В-клеточные антигены (CD20, CD79б) экспрессировались крупными бластными клетками с выраженным ядерным плеоморфизмом и высокой митотической активностью. Дискретное расположение последних среди плотного Т-компонента напоминало гистологическую картину варианта ДВКЛ, богатого Т-клетками (T-cell rich), однако экстрамедуллярный субстрат во всех случаях ДВКЛ был представлен центробластным или иммунобластным вариантами. Наиболее, с нашей точки зрения, важные результаты были получены при сравнении разных типов изменений в костном мозге с этапами клинического наблюдения больных и локализацией первичного субстрата. Из представленных таблиц следует, что подавляющее большинство больных с бластным поражением костного мозга имели первичную нодальную форму лимфомы и относились к группе высокого риска. Чисто бластное поражение определялось также у всех больных в рецидиве. Напротив, большинство случаев с реактивными лимфоцитозами в соответствии с IPI относились к группе низкого риска с преимущественной первичной экстранодальной локализацией опухоли. В группе смешанно-клеточной лимфоидной инфильтрации костного мозга число наблюдений с первичной нодальной и первичной экстранодальной локализацией разделились примерно поровну, а согласно с IPI превалировал низкий риск. Таким образом, обнаружение лимфоидной инфильтрации, морфологически отличающейся от основного экстрамедуллярного субстрата ДВКЛ, является абсолютным показанием для проведения иммуногистохимического исследования трепанобиоптата костного мозга. Диффузное бластное поражение костного мозга связано с невысоким бластозом в аспирате костного мозга вне зависимости от степени поражения по данным исследования трепанобиоптата, преимущественной нодальной локализацией первичного экстрамедуллярного субстрата, высоким риском в соответствии с IPI, минимальной Т-клеточной реакцией. Поражение по типу варианта, богатого Т-клетками, проявляется отсутствием или очень низкими пороговыми цифрами патологического бластоза в аспирате при достаточно выраженной картине в трепанобиоптате костного мозга, примерно в равном соотношении может наблюдаться при нодальной и экстранодальной формах, встречается в основном в группе низкого риска (в соответствии с IPI), характеризуется выраженной Т-клеточной реакцией. На наш взгляд, вполне правомочно предположение о возможной иммунореактивности Т-клеток в отношении бластного опухолевого субстрата ДВКЛ в этих случаях. Представляется перспективным дальнейшее изучение этого вопроса. Мелкоклеточная очаговая лимфоидная инфильтрация проявляется, как правило, незначительным лимфоцитозом в аспирате костного мозга, при отчетливой инфильтрации трепанобиоптатов. Во всех случаях нашего исследования она была представлена зрелыми Т-клетками, преимущественно ассоциирована с первичной экстранодальной локализацией экстрамедуллярного субстрата ДВКЛ и встречалась в основном в группе низкого риска (в соответствии с IPI). Полученные данные свидетельствуют о разнообразии типов поражения костного мозга при ДВКЛ, необходимости использования методов цитологии, гистологии, проточной цитометрии и иммуногистохимии в сочетании с иммуноморфологической характеристикой первичного субстрата лимфомы для более точного установления вовлечения костного мозга и анализа дискордантных ситуаций, связи поражения костного мозга с неблагоприятным течением лимфомы, феномене Т-клеточной реакции в костном мозге, ассоциированной в основном с первичной экстранодальной локализацией экстрамедуллярного субстрата ДВКЛ. Выявленные ассоциации могут служить лишь прологом к более фундаментальным исследованиям механизмов противоопухолевой активности и толерантности иммунной системы при НХЛ, в частности при ДВКЛ.

About the authors

E V Chigrinova

A I Pavlovskaya

N N Tupitsyn

References

Supplementary files