Metod protochnoy DNK-tsitometrii v prognozirovanii klinicheskogo techeniya raka slizistoy obolochki polosti rta i gortani

Full Text

С овременн ы й м етод проточно й цитометрии позволяе т с высокой точ нос ть ю на статистически достоверно м материале измерить количеств о исследуемых ве щ ест в в клетках и их ядрах. В основ е определения - измерение естественной л юм инесценци и или л юм инесценци и специальн ы х красителей, избирательно связ ы ва ющ ихс я с изучаемыми вещ ествами . О тдель но е м ест о среди м етодов проточно й цитометрии занимает ДНК -цитометрия. С воеобразие этог о м етода закл ю чается в том, чт о содер ж ани е ДНК в нормально й жи з неспособно й клетке не является постоянным, а зависит от фазы жи з ненно г о цикла клетки. При разн ы х ф орма х патологии количеств о ДНК в покоящ ейся ( неделящ ейся) клетке не всегда бы вает одинаков ы м (диплоидн ым ) , н о мож е т отклонятьс я о т нормальног о содер ж ания (анеуплоидия) в сторону ум еньш ения (гипоплоидия ) или чащ е - в сторону увеличения (гиперплоидия). П оследне е (гипердиплои- дия, триплоидия, тетраплоидия и т.д.) част о имее т м ест о при злокачественном росте . П олученны е с прибор а данн ы е оперативно в авто м атическом ре жим е вводилис ь в ЭВМ 1ВМ 286 , где обрабаты валис ь и анализировалис ь с помо щ ь ю специально разработанны х алгоритма и программы. В соответствии с программо й УАЮС2РС первичные данн ы е запис ы валис ь на дискеты, а окончательны е результаты выдавались в виде таблиц расчет а содерж ания клеток (%) в статистически з начимых пика х и промежуточных зо на х ( ф азах клеточ но г о цикла), а такж е в виде графиков ДНК -гистограмм. Оценка статистической з начимост и полученных величин производилась по специально разработанной Б.Н.Басовым программе [1]. Литература последних лет содер жи т сведения об информатив ности ДНК -плоид ности опухолевы х клеток при различн ы х новообразования х человека [2- 6] . П риведенны е работ ы подча с противоречив ы , не всегда в ып олнены на значитель но м количеств е наблю дений, чт о не позволяе т в полно м объеме судить о прогностической з начимост и определения ДНК -плоид ности для онкологической клиники. М етодом проточно й ДНК -цито метрии была изучена плоид- нос т ь ( популяционна я структура) рака слизистой оболочк и полост и рта и горта н и и проанализирована взаи мо связ ь указанного показателя с клиническими ф акторам и прогноз а (стадия заболевания, сро к возврат а заболева ния, продолжительност ь жизни, гисто морфологические параметры и др.) с цель ю в ы работки критерия прогнозирования тече ни я опухолевог о процесс а у оперированн ы х больны х. М етодом проточно й цитометрии изучены ДНК -цитогра ммы 20 5 опухоле й слизистой оболочк и полост и рта и гортани, представлявш ие собо й плоскоклеточные раки слизистой оболочки. П о содер ж ани ю ДНК опухоли слизистой оболочк и горта ни и роследних гипердиплоид ны х бы ло 29 (42,0 % ) , тетраплоид ны х - 37 (53, 6 % ) , гипертетраплоид ных - 2 (2, 9 % ) и поликлоновых 1 ( 1 , 5 % ) . П олученны е для 14 0 больн ы х ДНК -цито м етрические данн ы е были сопоставлены с м атериалам и историй болезней. У пациентов с I стадией заболева ни я преобладали диплоидн ы е опухоли, при II и III стадиях - анеуплоидн ы е новообразова ния , а при IV стадии диплоидн ы х и анеуплоидн ы х опухоле й б ы л о поровну. Средняя частот а возникновения возвратов составила 40 , 0 % . У больн ы х с анеуплоидн ым и новообразова ниям и возврат ы возникал и чаще, чем у пациентов с диплоидн ым и опухолями ( 63 , 1 и 20 , 0 % соответственно) . С развитие м заболева ни я (стад ии) преимущественно нарастало количеств о возвратов среди больн ы х с анеуплоидным и опухолями слизистой оболочк и полост и рта и гортани. В I-II стадии возврат ы у пациентов с анеуплоидн ым и опухолями составили 42 , 9 % а в III- IV стадиях - 64 , 5 и 81 ,8 %. П ри диплоидны х новообразова ния х частот а возвратов в аналогичн ы х стадиях составила 12,5; 20 , 0 и 31 ,6 %. Кумулятивная в ыжи вае мо ст ь больны х с диплоидн ым и и анеуплоидн ым и опухолями слизистой оболочк и полост и рта и горта ни к 5-летнему сроку наблю дения статистически з начимо (£><0,05) различалась и составил а 74 , 2 и 45 , 5 % . П риведенны е данн ы е характеризу ю т сумм арну ю картину тече ни я опухолевог о процесс а изученных опухоле й слизистой оболочк и полост и рта и гортани. О днако анализ материала показал, что среди изученных раков слизистой оболочк и ротово й полост и отсутствовали больны е с ранними (I-II ) стадиями заболевания. П оэтому б ы л о сочтено необходимым сопоставит ь плоид- нос т ь и тече ни е заболева ни я раздельно для пациентов с опухолями слизистой оболочк и горта ни и опухолями слизистой оболочки полост и рта. В с е изученные опухоли слизистой оболочк и горта н и были в половине случаев диплоидн ым и (47 ) и в половине - анеуплоидным и (47) . Среди анеуплоидн ы х опухоле й больш ая часть была тетраплоид но й (3 3 из 47) . При I-II стадиях заболева ни я преобладали диплоидн ы е ( 68 , 4 % ) , а при III- IV стадиях - анеуплоидн ы е новообразова ни я (5 9 , 6 % ) . Общ ая частот а возвратов опухоле й слизистой оболочк и горта ни составила 23 ,5 %. У больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями возврат ы возникал и в 6 раз чаще, чем у больн ы х с диплоидн ым и ( 6 , 4 % ) . С развитие м заболева ни я увеличивалос ь числ о возвратов среди больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями . Во зврат ы заболева ния чащ е обнаруживались при тетраплоидн ы х опухолях , их частот а нарастала по м ер е развития заболевания. Сроки возникновения возвратов при анеуплоидн ы х опухоля х все х стадий составляли 5- 6 м ес, при диплоидн ы х - более 2 4 мес. Рассмотрены взаимосвязь гистологической формы роста опухоли слизистой оболочки гортани и плоидности ДНК. У 56 больт 1 1 , л г вратов среди ни х была выш е (35 % ) , чем у больн ы х с диплоидным и новообразова ниям и горта ни (4,0 % ) . При с м е ш анно й ф орм е рост а частот а возвратов у пациенто в с анеуплоидн ым и опухолями бы ла статистически выш е, че м у больн ы х с диплоидн ым и опухоля м и ( 63 , 6 и 15 , 4 % ). Бол ьн ы х экзо фи т но й ф ормо й рост а слизисто й оболочк и горта н и б ы л о мало, и у ни х преобладали диплоидные опухоли. Во зврато в заболева ни я в это й группе не наблюдалось . В заи мо связ ь плоидност и ДНК и морфологической степени ди фф еренцировк и проанализирована н а пример е 9 3 опухоле й слизисто й оболочк и горта ни . Ч астот а возвратов заболева ни я при анеуплоидн ы х опухоля х с ороговение м бы ла в 8 раз выш е, че м пр и диплоидн ы х опухолях . Ч астот а возникновения возврато в анеуплоидн ы х неоро говева ющ и х опухоле й слизисто й оболочк и горта н и бы ла так ж е в ыш е ( в 4 раза), че м диплоидн ы х новообразований гортани. К ром е морфо логическо й оценки, степень ди фф еренцировк и опухоле й слизисто й оболочк и горта н и анализировал и н а основании классифи кации степени злокачестве ннос т и п о балльной систе м е [7] у 61 больного. Вы сокоди фф еренцированн ы х опухолей ( I степень ди фф еренцировки) в ы явлено 4 . Среди эти х больны х н е обнару ж ен о возвратов заболева ния . Ум еренно дифференцированн ы х опухоле й (II степень ) б ы ло 46 . Среди ни х преобладали диплоидн ы е новообразова ния . Во зврат ы у пациентов с анеуплоидн ым и опухолями в это й группе встречалис ь в 7,5 раза чаще, чем при диплоидн ы х ( р<0 , 05) . В группе больн ы х с ни зко- ди фф еренцированн ым и опухолями (III степень ) преобладал и анеуплоидн ы е новообразова ни я слизисто й оболочк и горта ни. Во зврат ы сред и последни х встречалис ь в 3 раз а чаще, че м пр и диплоидн ы х ( р<0 , 05) . П роанализирована кумулятивна я в ыжи вае мо ст ь больн ы х с опухолями слизисто й оболочк и горта ни. Выжи вае мо ст ь пациенто в с диплоидн ым и и анеуплоидн ым и опухолями статистически з начимо различалас ь на протяжени и 6 лет наблю дения и составила для диплоидн ы х опухоле й 77 ,3 %, а для анеуплоидн ы х - 57,0%. Кумулятивная в ыжи вае мо ст ь больн ы х с опухолями слизисто й оболочк и полост и горта ни III- IV стадий к 6 годам наблюдения при диплоидн ы х опухолях составила 74 ,1 %, при анеуплоидны х - 36 , 0 % ( р<0 , 05) . За 6 лет наблю дени й ум ерли 6 ( 12 , 7 % ) из 47 больн ы х с диплоидн ым и опухолями и 15 (32,5 % ) из 46 больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями. Таким образом, ф актическа я смертнос т ь больн ы х при анеуплоидн ы х опухолях слизистой оболочк и горта н и была в 3,5 раза выше, чем при диплоидн ы х ( р<0 , 05 ) (см . рисунок). П роанализирована в ыжи вае мо ст ь больн ы х с диплоидн ым и опухолями слизистой оболочк и горта ни в сравнении с гипердиплоидн ым и и тетраплоид ными . В ероятност ь 6-летней выживае мо ст и у больн ы х с диплоидн ым и опухолями была выше, че м у пациенто в с гипердиплоид ным и и тетраплоид ным и опухолями в 2,1 и 2,8 раза соответственно ( р<0 , 05) . Также была исследована связ ь плоидности, применяемог о лечения и возникновения возвратов заболева ния . Только оперативному вм еш ательству чащ е подвергалис ь больн ы е с опухолями слизисто й оболочк и горта ни, че м пациент ы с опухолями слизисто й оболочк и полост и рта. П ри I-II стадиях опухоле й слизисто й оболочк и горта ни произведено 35 операций (2 5 больны м с диплоидн ым и и 10 - анеуплоидн ым и новообразова ниями ) , а при III- IV стадии - 26 операций ( 1 0 больн ы м с диплоидн ым и и 16 - с анеуплоидн ыми). Среди оперированн ы х возврат ы отмечалис ь у 2 (5,7 % ) из 35 пациенто в с диплоидн ым и опухолями и у 8 (30, 1 % ) и з 26 больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями. В с е анеуплоидн ы е опухоли слизистой оболочк и гортани, не зависи м о от стадии заболевания, при одно м хирургическом лечении характеризовалис ь боле е част ым и возвратами . В ероятност ь в ыжи ть посл е одно г о хирургическог о лечения для больн ы х с диплоидн ым и опухоля м и была в 3 раз а выш е, че м для неуплоидными ( р<0 , 05) . Среди первых ум ерли к 6-летнему срок у наблю дения 2 (5,7 % ) из 35 , среди втор ы х - 6 ( 19 , 2 % ) из 26 . П ослеоперационна я лучевая терапия, преиму щ ественно прим еняем ая при III- IV стадии заболева ния, проведена у 21 больного с опухолями слизисто й оболочк и горта ни. С реди ни х при диплоидн ы х опухоля х возврат ы бы ли в 1 ( 11 , 1 %) из 9 , а при анеуплоидных - в 7 (58,3 % ) из 12 случаев. Среди больн ы х с диплоидн ым и опухолями к 5-летнему сроку наблю дения погибли 3 (33,3 % ) из 9 , а сред и пациенто в с анеуплоидн ым и - 6 (50,0 % ) из 12 . Пятилетняя кумулятивна я в ыжи вае мо ст ь больн ы х с диплоидн ым и опухолями составила 57 ,8 %, с анеуплоидн ым и - 43 , 6 % ( р<0 , 05) . Вероятно, лучевая терапия бы ла боле е э фф ективной при диплоидн ы х опухоля х слизистой оболочк и гортани, чем при анеуплоидн ых. 22 (44,0 % ) . Ч астот а возвратов у больн ы х диплоидн ым и опухолями Ш -ГУ стадии составила 33 , 0 и 38 ,5 %, у больн ы х анеуплоидными опухолями - 55 ,5 и 100 , 0 % соответственно. У 22 больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями преоблада л гипердиплоид ный рак - 85 , 3 % ( 19 ) . Во зврат ы у больн ы х с диплоидн ым и опухолями возникали в срок и посл е 12 м ес, у больн ы х анеуплоидн ым и - раньше. С вязь плоидност и ДНК с гистологически м и ф ормами рост а опухоле й слизистой оболочк и полост и рта проанализирована у 49 больн ы х . Ч астот а возвратов у больн ы х с анеуплоидн ым и опухоля м и в группе с инфильтративным росто м бы ла вдво е больш е, че м с диплоидн ым и (8 6 , 9 и 33 , 0 % соответственно) . П ри смешанно й ф орм е рост а частот а возвратов у больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями составила 66 , 6 % , с диплоидн ым и - 50 ,0 %, при экзо - фи тно м рост е - у 25 , 0 % больн ы х диплоидн ы м и у 100 % анеупло- идным раком. Н езависи м о о т ф орм ы рост а об щ а я частот а возврато в б ы л а в ыш е пр и анеуплоидн ы х опухолях , че м при диплоидных (8 1 , 8 и 33 , 3 % ) . П роанализирована связ ь между плоидность ю и степень ю злокачественност и 25 диплоидн ы х и 22 анеуплоидн ы х опухоле й слизисто й оболочк и полост и рта. Среди 6 вы сокоди фф еренцированн ы х опухоле й возврат ы н е обнаруж ен ы . С реди 22 случаев у м еренно ди фф еренцированн ы х новообразова ни й возврат ы обнаружены у 62 , 5 % больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями слизисто й оболочк и полост и рта. В группе пациентов с низкоди фф е- ренцированн ым и опухолями при анеуплоидн ы х опухоля х возврат ы отмечены в 100 , 0 % случаев. Таким образом, возврат ы заболевания чащ е наблю далис ь у больн ы х анеуплоидн ым и опухолями с ум еренно й и ни зкой степень ю дифф еренцировки, че м при диплоидн ы х опухолях аналогичной степени дифф еренцировки. П роанализирована кумулятивная в ыжи вае мо ст ь больн ы х опухоля м и слизисто й оболочк и полост и рта. О бнару ж ен о статистически достоверно е различие в в ыжи вае мо ст и больн ы х с диплоидными и анеуплоидн ым и опухолями. Выжи вае мо ст ь при диплоидных опухоля х к 5-летнему сроку наблю дения составил а 74 ,7 %, при анеуплоидн ы х - 29 , 0 % ( р<0 , 05) . Ф актическа я с м ертност ь больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями также была в 2,8 раза выше. За 5 ле т из числ а больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями умерли 14 ( 66 , 7 % ) , а с диплоидн ым и - 6 (23,7 % ) . Рассмо тре н а связ ь плоидност и ДНК, частот ы возвратов заболевания и примененног о лечения. Больн ы е с опухолями слизистой оболочк и полост и рта сначала подвергалис ь сохранно й операции, затем лучевой терапии ( п=25 ) либ о хи мио терапии с последующ ей операцие й ( п=24 ) . Кумулятивная в ыжи вае мо ст ь больн ы х с диплоидн ым и опухолями при первом вариант е лечения к 4-летнему сроку наблюдения составил а 92 , 9 % , пациенто в с анеуплоидн ым и новообразова ниями - 11 , 1 % ( р<0 , 05) . В ероятност ь в ыжи т ь для больн ы х с диплоидн ым и опухолями была выше, че м для больн ы х с анеуплоидным и новообразова ниями . П рименени е второ й схе м ы лечения показал о боль ш у ю в ыжи вае мо ст ь больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями (7 1 , 4 % ) , чем с диплоидн ым и (57,7 % ) ( р<0 , 05) . Вероятно, лучевая терапия при комбинированно м лечении опухоле й слизистой оболочк и полост и рта была боле е эфф ективной для диплоидн ы х опухолей, а хи мио терапия - для анеуплоидн ых. С цель ю детальног о анализ а исследуемой группы больн ы х расго тече ни я опухоли данно й локализации. В един ы е схе м ы весов ы х функций вклю чалис ь характеристики возраста, стадии заболевания, ф ормы роста, плоидност и опухоли, степени злокачест венности, локализация и вид лечения. П олн ы й комплек с исследуе мы х параметров в весов ы х функциях дал наиболе е демонстратив ну ю картину влияния перечисленных параметров на прогно з жи з н и каж дого больног о и воз можно ст ь сравнит ь величину влияния ф акторов относительно друг друга по степени важности. Анализ з начимост и по убы вающ ей весо мо ст и признаков при пятилет не м прогноз е показал первостепенно е значение плоидности опухоли, а также ва жн ост ь сроко в возникновения рецидивов , вида лечения, степени злокачестве нности, стадии заболева ни я и локализации опухоли. Так как наиболе е информативным признаком прогноз а заболевания для все х изученных опухоле й является ДНК -плоид ность опухолевы х клеток, были рассмотрены и вероятност и прогноз а тече ни я заболева ни я отдельно для группы больн ы х с диплоидными ( п=125 ) и группы больн ы х с анеуплоидн ым и опухолями ( п=81 ) слизистой оболочк и полост и рта и гортани. Проанализированы параметры, характеризу ющ и е основн ы е клинико-мор- ф ологические характеристики больн ы х раком слизистой оболочк и полост и рта и гортани. Анализ з начимост и изученных параметров в соответствии с Б-критерием Ф иш ера позволил определит ь коэффициент информативност и каждого из ни х на прим ере 5-летнего тече ни я заболева ния. При это м получено сходно е в последовательност и распределение признаков , как для диплоидных , так и для анеуплоидн ы х опухолей. Тем не менее, несмотр я на ре ш а ющ е е прогностическое значение ДНК -плоид ности на прогно з заболева ния, в случае диплоидн ы х опухоле й важн ы сроки возникновения рецидива , а при анеуплоидн ы х опухоля х - стадия развития заболева ния. Во зрас т больног о практическог о влияния на прогно з заболева ни я не оказывает. Таким образом, п о результатам мно го ф акторног о анализ а ДНК -плоид ности и клинических показателе й тече ни я опухолевог о процесс а при опухолях слизистой оболочк и полост и рта и горта ни отмечена первостепенна я диагностическа я з начимост ь ДНК -плоид ности. При это м ДНК-диплоидия опухоле й явилас ь наиболе е весо мы м показателе м благоприятног о прогноз а заболевания. ДНК-анеутшоидия в такой же степени указывала на неблагоприятны й 5-летний прогно з опухолевог о процесса . Раздельны й анализ клинических показателе й тече ни я заболева ни я диплоидн ым и и анеуплоидныхми опухолями показал, чт о для прогно за первых наиболе е важны м б ы л о поздне е появление рецидивов, для втор ы х - боле е ранняя стадия развития процесса . В итог е можн о отхметить, чт о среди опухоле й слизистой оболочки полост и рта диплоидн ы е и анеуплоидн ые новообразования встречалис ь приблизительно с одинаковой частотой. Независи м о от стадии заболева ни я частот а послеоперационн ых возвратов опухолевог о процесс а для анеуплоидн ы х опухоле й была в 1,5-3 раза выше. При все х изученных клинически неблагоприят ны х гистологических ф орма х рост а опухоли ( инфильтративная, с м е ш анная ) преобладали анеуплоидн ы е опухоли. Ч астот а возврато в заболева ни я в предела х изученных гистологических ф орм была связана, главным образом, с анеуплоидией. П ри плоскоклеточны х ( неоро говева ющ и х и ороговева ющ их ) опухоля х слизистой оболочк и горта ни частот а возвратов заболева ни я такж е была выш е при анеуплоидн ы х опухолях , чем при диплоидн ы х, и в больш ей степени зависела от анеутшоидии, чем от степени ди фф еренцировки. Во з никновени е возврато в заболева ни я и длительност ь безрецидивног о период а также в больш ей степени были связаны со значение м ДНК -плоид ности, чем со степень ю ди фф еренцировки опухолей. П оэтому анеуплоидию ДНК опухолев ы х клеток, по-видимому , следует рассматриват ь как высокоинформативный не зависи мы й ф актор неблагоприят но го прогноза рака слизистой оболочк и полост и рта и гортани. П роведенн ы е нами исследования плоскоклеточног о рака голов ы и шеи и данн ы е литературы свидетельствую т о в ы соко й инф ормативно й з начимост и для прогноз а послеоперационног о течения опухолевог о процесс а определения ДНК -плоид ности опухолев ы х клеток в новообразова ниях . П оказано, чт о анеуплоидия опухоле й с в ы соко й степень ю вероятност и сопрово ж дается более ранними и боле е частым и послеоперационными возвратам и опухолевог о процесс а ( м етастаз ы и рецидивы ) , что влечет за собой су щ ественное сокра щ ени е жи з н и оперированн ы х больн ы х по сравнению с обладателями диплоидн ы х опухолей. Н аиболе е прогностически неблагоприят ным и ф ормами анеутшоидии являю тся мно гокло новые опухоли. П остроенн ы е нами кривы е кумулятивной в ыжи вае мо ст и больн ы х перечисленными видами новообразова ни й (см. рисунок ) четко подразделялис ь на 2 группы для больн ы х диплоидн ым и и анеуплоидн ым и опухолями. ДНК -цито м етрическое прогнозирование дает основани е для ф ормирования среди оперированн ы х больн ы х групп повышенно г о риска возврат а заболева ни я с цель ю интенсивно й специфическо й противорецидивно й терапии. Таким образом, ДНК-анеутт- лоидия является до миниру ющ и м неблагоприят ны м прогностическим ф актором для изученных новообразова ни й человека. Литература

About the authors

T G Nikolaeva

A A Akhundov

S O Podvyaznikov

Ya V Dobrynin

References

Supplementary files