Issledovanie vozmozhnykh mekhanizmov regulyatsii rosta razlichnykh novoobrazovaniy u detey

Full Text

Известно, что одной из причи н неконтролируе мого роста клеток, способног о приводит ь к возникновению злокачестве нных новообразований, может явиться продукция этими или соседними клетками полипептидов, стимулирующих пролиферацию так называемых ф акторов роста. В отличие от гормонов, которые синтезируются клетками эндокринн ы х желез и переносятся в крови к клеткам органов-мишеней, локальные ф акторы роста действуют ауто- или паракринным путем, т.е. акцептором последних служит сама продуцирующая ф актор клетка или соседняя. Одним из наиболе е изученных ф акторов роста в настоящее время является эпидермальный ф актор роста (ЭФР) и а-трансф ор- мирующий ф актор роста (а-ТФР), который имеет примерно 40% гомологию с ЭФР. Их общ ий рецептор, именуемый в дальнейшем Р-ЭФР, представляет собой крупный трансмембранный белок с молекулярной массой 170 ООО дальтон и длиной 1180 аминокислотных остатков. Р-ЭФР был выделен в начале 80-х годов из лини и клеток эпидер моидной карциномы человека. Позднее рецептор был обнаружен почт и во всех нормальных тканях организма человека, кроме клеток, происходящ их из системы гемо- поэза [1]. В отнош ении пролиферации важность ЭФР была показана путем использования антител к рецептору, что вело к обратимому аресту роста клетки в фазе во клеточног о цикла [2]. Наконец, повышенная экспрессия Р-ЭФР вызывала злокачестве нную тра нсформаци ю клеток культуры МН - ЗТЗ [3, 4]. Известно, что в некоторых тканях регуляция пролиферации осуществляется эндокринн ы м путем, в частности, путем взаимодействия стероидных гормоно в со своими рецепторами, расположенн ыми в цитозолях клеток. Интересна взаимосвязь данног о процесса с описанным и выше ауто- и паракринными механизмами пролиферации клеток опухолей. Механизм, посредством которог о гормоны регулируют пролиферацию клеток, пока не изучен в достаточной степени, известно лишь, что гормоны могут стимулировать рост опухолей опосредовано, действуя на синтез и секрецию локальных ростовых ф акторов и их рецепторов [5]. В то же время характерной особенность ю злокачестве нных опухолей, которые наиболе е часто встречаются в клинике детской онкологии, является возможная полная или частичная утрата ими зависи мости от внеш них центральных регуляторов, в частност и гормонов, и, как следствие, автономный "самоподдерживающийся" рост, регулируемый локально продуцирующимися факторами. Вмешательство в процесс ы секреции ростовых факторов, особенно в процессы восприятия и передачи их рост-сти- мулирующих сигналов, может оказаться новым перспективным подходом к терапии злокачестве нных новообразований у детей. Наряду с мно гочисле нным и исследованиями, вы являющ ими роль Р-ЭФР системы в возникновении и развитии новообразований, разрабатываются и методы воздействия на эту систему приводящие к блокированию или сни ж ению ее способност и индуцироват ь митогенный сигнал. Для разработки и испытания новых схем терапии тех новообразований, где передача сигнала осуществляется через Р-ЭФР, уже имеется значительная теоретическая и экспериментальная база, включающая, в частности, и препараты, влияющие на рецепторы эпидермальног о фактора роста. Для определения эфф ективност и применения этих агентов необходимо определение индивидуальной чувствительност и к ним, индикатором которой может служить наличие и концентрация Р-ЭФР и рецепторов стероидных гормоно в на мембранах клеток опухолей больных. М атериалы и метод ы исследования . В исследование включены 42 мальчика и 28 девочек со злокачестве нными и доброкачественными опухолями различных локализаций, лечившихся в НИИ ДОГ и НИИ КО в период с 1993 по 1997 г. (табл. 1). Соотнош ение исследованных образцов злокачестве нных, доброкачественных опухолей и неизм ененно й прилежащей к опухоли ткани показано на рис. 1. Как следует из рис. 2, из всех злокачестве нных новообразовани й наибольшую группу составляли опухоли костей, в основном остеогенная саркома. О сновн ы е методы. О бразцы опухолей массой 500 мг, полученны е в результате операций или биопсий, доставляли на льду в лабораторию и либо сразу же подвергали гомогенизации, либо хранили пр и -70°С до исследования соответствующих показателей. Исследование содержания Р-ЭФР в м ембранной ф ракции клеток проводилос ь моди фицированн ы м радиолигандным методом Вепгааб&Боекепз (1990). П робы считали рецепторположительными при содержании Р-ЭФР свыше 5 фмоль/мг белка. В каждо: серии исследований в качестве положительног о контроля каче ства определяли содержание Р-ЭФР в контрольном стандартно] материале мембран плацент ы человека. В серии из 10 опытов сс держание Р-ЭФР в контрольном материале колебалось в преде лах 2501-4262 фмоль/мг белка (3261 ± 172; e.V. = 17%). В цитозс лях клеток опухолей и нормальных тканей определяли содержа ния рецепторов стероидных гормоно в конкурентным радиолг гандным методом с использование м разделения свободног о связанног о с рецептором гормона на активированном угле (Nor А), покрытом декстраном 70-100. Границе й рецепторположг тельности для рецепторов андрогенов считали 5 фмоль/мг бел к; а для рецепторов эстрогенов и глюкокортикоидов - 10 фмоль/ м белка. Результаты исследования . Количество Р-ЭФР-положител1 ных опухолей составило 57% от количества всех исследованны образцов. В злокачестве нных новообразованиях Р-ЭФР обнар^ живали в 55% случаев, в доброкачественных опухолях - в 75% во всех неизм ененн ы х тканях, прилегающ их к опухоли. Наибольш ий уровень экспрессии Р-ЭФР обнаруживали в образцах фиброаденомы молочной железы - 335 ± 106 фмоль/мг белка, а среди злокачестве нных новообразований - в образцах нейроблас - томы - 153 ± 53 фмоль/мг белка. П ри нефробластоме и раке щитовид ной железы уровень Р-ЭФР в опухоли был выше, чем в прилегающей неизм ененно й ткани, а при гепатобласто ме это соотнош ение было обратным. В табл. 2 показаны средний уровень Р- ЭФР и частота их экспрессии в зависи мости от нозологической ф орм ы опухоли. Распределение и уровень Р-ЭФР по исследованным образцам показаны на рис. 3 И зуче ние содер ж ани я рецепторо в стероидн ы х гор моно в (Р-СГ) в опухолях проводил и с учетом нозологической ф орм ы опухоли и, в некотор ы х случаях, пола пациентов . Самую большую группу обследованных составляли больные с остеогенной саркомой. Во всех опухолях определяли содержание рецепторов эстрогенов (РЭ), андрогенов (РА) и глюкокортикоидов (РГ)- Частота обнаружения в остеогенной саркоме РЭ - 28%, РА - 20% и РГ - 54%. П ри саркоме Ю инга уровень РЭ был 20 фмоль/мг белка, РА - 5,4 фмоль/мг белка, а РГ не было вообще. Опухоль Аскина не содержала рецепторов стероидн ы х гор моно в и Р-ЭФР. Самый высокий уровень РЭ был обнаружен в неизм ененно й ткани печени - 28,5 фмоль/мг белка, РА - в липо м е - 28,1 фмоль/мг белка и РГ - в остеогенной саркоме - 70,3 фмоль/мг белка. П ри нефробластом е содержание рецепторов в опухоли и неизмененно й ткани почки практически не различалось: РЭ - 14,5 и 17,7 фмоль/мг белка, РА не было, а РГ - 21 и 23,4 фмоль/мг белка соответственно. П ри опухолях печени РЭ и РГ обнаруживали только в неизм ененно й ткани печени - 28,5 и 48,4 фмоль/мг белка соответственно, а РА - в опухоли - 12,4 фмоль/мг белка. Данные о распределении рецепторов стероидн ы х гор моно в в опухолях у детей приведены на рис. 4, 5, 6. Связь экспрессии Р-СГ и Р-ЭФР в опухоля х Наличие в клетке рецепторов стероидных гормоно в и/или рецепторов роста может явиться одним из критерие в чувствительности к локальным или центральным механизмам регуляции ее пролиферации. Таким образом, было бы интересно выяснить, как сочетаются эти два типа рецепторов в различных опухолях. Все опухоли были распределены по следующим фенотипа м: РЭФР+РСГ+, РЭФР+РСГ-, РЭФР-РСГ+ и РЭФР-РСГ-. П ри остеогенной саркоме 41 % опухолей принадлежа л к фенотипу РЭФР+РЭ- и столько же к ф енотипу РЭФР-РЭ-, 10% - к фенотипу РЭФР+РЭ+ и 8% были РЭФР-РЭ+; 46 % опухоле й бы ли РЭФР+РА-, 41 % - РЭФР-РА-, 8% - РЭФР+РА+ и 5% принадлежали к ф енотипу РЭФР-РА+. Распределение сочетаний Р-СГ и Р-ЭФР было более равномерным: по 26% опухолей принадлежали к фенотипам РЭФР+РГ-, РЭФР+РГ+ и РЭФР-РГ+ и 22% были РЭФР-РГ-. Распределение опухолей по сочетаниям РЭФР-РСГ показано в табл. 3 и на рис. 7, 8. О бсу ж дени е результатов. На данном начальном этапе исследования можно констатировать, что ЭФР-зависимый путь передачи митогенного сигнала, вероятно, играет определенную роль в регуляции пролиферации доброкачественных и злокачественных новообразований различног о гистогенеза у детей. Четкой взаимосвязи частоты и уровня экспрессии Р-ЭФР с нозологической ф ормо й опухоли не обнаружено. Выявлен высокий процент РЭФР-положительных образцов при опухолях костей, неф- робластомах. В то же время пр и опухолях печени уровень РЭФР был ниже в опухоли, чем в неизм ененно й ткани печени, при не- фробластома х достоверных различий между неизм ененно й тканью почки и опухолью не наблюдалось, а пр и раке щ итовидной железы уровень Р-ЭФР был выше в опухоли, чем в ткани железы. Как следует из рис. 7, среди злокачестве нных опухолей довольно высок процент ф енотипов РЭФР+РСГ- (30-45%) и РЭФР-РСГ- (25- 40%), что свидетельствует в первом случае о преобладании ауто- и паракринно й регуляции роста опухолей, а во втором - о наличии каких-либо других механизмов влияния на опухоль. Полагаем, что дальнейшее накопление материала о содержании РЭФР и РСГ в опухолях у детей и наблюдении за больными может оказаться полезным для разработки новых ф акторов прогноз а и терапии солидных опухолей у детей. Закл ю чение . Воздействие на процесс ы регуляции пролиферации и передачи митогенного сигнала в опухолевых клетках является в настоящее время новым перспективным подходом в терапии опухолевых заболеваний. Блокирование любого из этапов передачи митогенного сигнала ф акторов роста может, в принципе, привест и к наруш ению регуляции пролиферации опухолевых клеток и, потенциально, к тор можению роста опухоли. В эксперимент е уже исследовано достаточно большое количество препаратов, влияющих на эти процессы: специ фические и неспецифические блокаторы связывания РЭФР с лигандами, ингибиторы тирози нкиназы, блокаторы связывания SH2 доменов э ф - ф екторн ы х белков с активированн ым рецептором, соединения, подавляющие активацию гена ras, и др. [6-8]. Большинство из них находятся на стадии предклиническог о изучения, хотя ряд препаратов (в частности, моноклональные антитела к РЭФР) уже прош ли I фазу клинических испытаний и показали себя достаточ н о эфф ективн ым и пр и некоторых видах опухолей. Данные экспериментальног о и клиническог о изучения рассмотрены в обзорах [9, 10]. П риведенные результаты исследования РЭФР-за- висимого пути передачи митогенного сигнала и его связи с наличием гормональной регуляции роста новообразова ний свидетельствуют о том, что набор показателей и количественные критерии, используемые для оценки потенциальной чувствительности опухолей к препаратам, влияющим на эти процессы, могут существенно отличаться для больных с опухолями различных локализаций и гистологическог о строения, поэтому необходимс проводит ь специальные исследования при каждой из нозологии

About the authors

K O Dumbrays

N E Kushlinskiy

E S Gershteyn

T G Glazkova

V N Baykova

L A Durnov

References

Supplementary files