Circulating tumor cell: biology, methods of isolation, clinical significance in breast cancer

Full Text

Введение Рак молочной железы (РМЖ) устойчиво занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости у женщин. При этом у 32% впервые заболевших женщин в нашей стране диагностируется III или IV стадия РМЖ [1]. Тактика лечения РМЖ определяется степенью распространенности опухолевого процесса, т.е. стадией заболевания. Стандартными клиническими показателями стадии РМЖ являются размер первичной опухоли, состояние регионарных лимфатических узлов и наличие или отсутствие отдаленных метастазов. Однако, по данным литературы, приблизительно у 25% пациенток с первично-локализованным РМЖ без поражения регионарных лимфоузлов после успешно проведенного лечения выявляются отдаленные метастазы. В то же время почти у 30% больных с первоначальными метастазами в подмышечные лимфоузлы после окончания лечения отмечается длительный безрецидивный период [2, 3]. В настоящее время активно изучаются биологические подтипы РМЖ. Молекулярные особенности РМЖ широко используются в рутинной клинической практике для определения тактики лечения. Одним из предикторов метастатического поражения и неблагоприятного отдаленного прогноза являются циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). В то же время применение ЦОК в рутинной клинической практике затруднено в связи с недостаточной точностью разработанных диагностических систем и гетерогенностью популяций ЦОК [4]. Поэтому представляются актуальным изучение количественного и качественного состава опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови больных РМЖ, а также отработка методологии их выявления. Впервые инвазию опухолевыми клетками вен и лимфатических сосудов у больного базально-клеточным раком кожи обнаружил Tirsch в 1865 г. В 1869 г. T.Ashworth сообщил о наличии опухолевых клеток в сосудах больного, умершего от метастатического рака: «…клетки, похожие на клоны клеток из первичной опухоли, будучи выявленными в периферической крови, могут проливать некоторый свет на способ происхождения множественных опухолей, существующих в том же самом человеке» [5]. В последнее десятилетие получают бурное развитие новые методы идентификации, подсчета и фенотипирования циркулирующих в крови опухолевых клеток. Биологические особенности ЦОК ЦОК являются ключом к пониманию биологии метастазов и биологическим маркером нового поколения, позволяющим неинвазивно изучать эволюцию генотипа опухоли во время ее прогрессии, в том числе под влиянием проводимого лечения. ЦОК представляют собой гетерогенную популяцию клеток опухоли, которые попали в кровеносное русло. С цитопатологической точки зрения под данным термином подразумевается наличие разных типов опухолевых клеток, таких как эпителиальные опухолевые клетки, мезенхимальные опухолевые клетки, клетки с гибридным эпителиально-мезенхимальным фенотипом, стволовые клетки и опухолевые микроэмболы [6]. Описаны 2 пути попадания эпителиальных и мезенхимальных опухолевых клеток в кровоток. Первый - пассивный, связанный с разрушением базальной мембраны. Вероятно, клетки, попадающие таким образом в кровоток, погибают и не дают метастазов. Второй путь - активный. Он связан с таким явлением, как эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). ЭМП определяется как элемент метастатического процесса, во время которого происходят морфологические трансформации клеток, проявляющиеся изменением размера и формы клеток, наблюдаются плеоморфизм клеток и ядер, гиперхромазия и гиперплоидность, а также отмечается увеличение их митотической активности. Считается, что ЦОК являются ключевым звеном метастатического каскада - биологического феномена, который начинается с процесса ЭМП [7]. Феномен ЭМП впервые описан Elisabeth Hay и соавт. в 1995 г., исследовавшими его на куриных эмбрионах [8]. После активации протоонкогенов (Src, Ras) и фазы инициации в эпителиальных клетках активируются «скрытые» эмбриональные программы ЭМП, в результате чего клетка постепенно теряет набор эпителиальных антигенов (панцитокератины) и приобретает мезенхимальные признаки (экспрессия виментина, гладкомышечного актина, фибронектина). ЭМП встречается как в физиологических условиях (эмбриональный морфогенез, разные виды воспаления, формирование фиброза), так и в ходе канцерогенеза. Клетки при ЭМП приобретают свойства злокачественности и реализуют их в процессе метастазирования. А сам феномен ЭМП оказывает влияние на формирование гетерогенности ЦОК, которой обусловлены трудности обнаружения и фенотипирования клеток [6]. Эпителиальные клетки в кровотоке имеют очень низкую выживаемость: более 85% из них погибают, превращаясь в апоптотические тельца. Этому способствуют гемодинамический стресс и взаимодействие с клетками иммунной системы. Для того чтобы эпителиальные клетки смогли выйти в кровоток и выжить там, необходимо два условия: 1. наличие мезенхимальных свойств, которые позволяют клетке проникать через базальную мембрану и попадать в кровоток; 2. активация антиапоптотической программы. Клетки с мезенхимальным фенотипом, в свою очередь, способны выживать только в преметастатической нише, в качестве которой могут выступать ткани висцеральных органов, костный мозг и первичная опухоль (феномен метастазирования «в себя») [6]. Экспериментально было установлено, что ежедневно из 1 г опухолевой ткани может поступать в кровоток от нескольких тысяч до 4 млн опухолевых клеток. При этом лишь 1 клетка из 40 может достигнуть преметастатической ниши и не более 0,01% клеток реализуются в макрометастаз [6]. Некоторые клетки сохраняют способность циркулировать в кровотоке в течение длительного времени. Так, солитарные злокачественные клетки обнаруживаются в крови больных РМЖ через 10 лет и более после завершения радикального лечения [9]. Основные методики идентификации ЦОК Изучение феномена ЦОК затруднено разнообразием и недостаточной эффективностью применяемых методик, поскольку речь идет о выявлении единичных клеток в среде, насчитывающей миллиарды обычных клеток крови. Так, в 1 мл крови единичные циркулирующие раковые клетки окружены 10 млн лейкоцитов и 5 млрд эритроцитов. Соответственно, в 10 мл крови солитарные опухолевые клетки смешиваются со 100 млн лейкоцитов и 50 млрд эритроцитов. Однако обнаружение и идентификация в кровотоке ЦОК представляются очень непростой задачей не только из-за малого количества эпителиальных клеток, окруженных многочисленными клетками крови, но и из-за гетерогенности опухолевых клеток [9]. Экспериментальные доказательства гетерогенности опухоли с точки зрения метастатического потенциала были представлены I.Fidler и М.Kripke в 1977 г. [10]. Это обстоятельство требует использования методов идентификации, характеризующихся как исключительно высокой чувствительностью, так и высокой точностью и специфичностью. Наиболее распространенные на сегодняшний день иммунные и молекулярно-генетические методики выявления и анализа ЦОК высокочувствительны, однако недостаточно специфичны и не позволяют изучать морфологические особенности ЦОК [11]. Приступая к обсуждению методов выделения и оценки ЦОК, необходимо уточнить, чем эти клетки отличаются от обычных клеток крови. В настоящее время известно, что ЦОК в большинстве случаев несколько больше по размеру, чем обычные клетки крови [12], а также экспрессируют на своей поверхности эпителиальные молекулы клеточной адгезии (EpCAM). EpCAM является специфичным для опухолевых клеток маркером, поэтому исследователи чаще всего используют именного его для выявления ЦОК. При РМЖ в качестве маркеров ЦОК в крови могут применяться цитокератин 19, эпителиальный муцин (MUC1 и MUC2) или маммаглобин [13]. Учитывая тот факт, что некоторые эпителиальные маркеры подавляются во время ЭМП, современные подходы к выделению ЦОК должны включать одновременное использование нескольких маркеров. На сегодняшний день существует множество способов и технологий для выделения и обогащения ЦОК. Наиболее часто применяют: иммуномагнитные, фильтрационные (основанные на размере и других физических свойствах клетки) технологии, в которых используются портативные чипы и фильтровальные микроустройства. Среди систем обнаружения ЦОК заметную роль играют методики, подразумевающие прямую визуализацию клеток, например: иммуноцитохимические методы, иммуномагнитная сепарация CellSearshR system, система Ariol, автоматическая цифровая микроскопия (FAST+ADM) и лазерная сканирующая цитометрия (MAINTRAC). Наиболее популярны в настоящее время: технология автоматической цифровой микроскопии (ADM) и массивное оптоволоконное сканирование (FAST). Использование FAST и ADM совместно помогает выявить очень редкие эпителиальные клетки из всего образца крови после предварительной обработки флюоресцентно-мечеными антителами к цитокератинам. Другой метод обнаружения циркулирующих эпителиальных клеток из цельной крови - MAINTRAC - заключается в использовании сканирующей лазерной цитометрии образцов крови, окрашенных антителами против клеток, экспрессирующих EpCAM и не обладающих лейкоцитарным маркером CD45. Применяются молекулярные исследования, основанные на анализе нуклеиновых кислот, в том числе высокочувствительные методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, мультиплексные обратно-транскриптазные ПЦР-исследования. Разработан метод, основанный на обнаружении белка, высвобождаемого ЦОК, - EpiSpot. Фенотипирование и определение индивидуальных биологических характеристик клеток проводятся после их идентификации [13]. Иммуномагнитные методы основаны на взаимодействии опухолевых клеток с антителами против маркеров ЦОК с конъюгированными магнитными частицами - CellSearch, Ariol и др. Многие исследователи при определении ЦОК в крови пациентов больных РМЖ использовали систему CellSearch® компании Veridex. Данная технология получила одобрение Управления по контролю за продуктами питания и медицинскими изделиями США (Food and Drug Administration, FDA) для выявления уровней ЦОК у пациентов с метастазами РМЖ, простаты, толстой кишки. Система позволяет выявить циркулирующие EPCAM(+), CD45(-) клетки. При использовании данной технологии образец крови помещается в аппарат, где обогащается магнитными частицами. Идентификация клеток осуществляется с помощью флюоресцентно-меченых к EPCAM антител, лейкоцитарному антигену CD45 и ядерному красителю DAPI. В результате реакции опухолевые клетки взаимодействуют с намагниченными к EPCAM (зеленая метка) и CD45 (красная метка) антителами. Далее под воздействием магнитного поля опухолевые клетки остаются на поверхности и автоматический счетчик считывает количество клеток, исключая лейкоциты (CD45+). Таким образом, система позволяет не только отделить лейкоциты от циркулирующих эпителиальных клеток, но и подсчитать последние. По данным некоторых исследователей, чувствительность данного прибора составляет около 5 ЦОК на 7,5 мл крови. Подобный принцип работы реализован в еще одной системе под названием Ariol (Genetix) [13]. Перспективная с клинической точки зрения технология CTC-chip, основанная на микропроточной системе, позволяет с высокой специфичностью количественно определить наличие ЦОК в образце крови при помощи связывания клеток с антителами против EpCAM, которыми покрыты ячейки чипа. Через чип пускается образец крови в строго определенных условиях ламинарного течения. Авторы методики демонстрируют чувствительность 99% при анализе достаточно малых объемов крови (2-3 мл) [13]. Для обнаружения жизнеспособных клеток используется функциональный тест EPISPOT (Epithelial ImmunoSPOT). Жизнеспособность клеток считается очень важным признаком, поскольку эти клетки могут участвовать в образовании метастазов. Данная технология оценивает присутствие ЦОК на основе выделяемых ими белков в процессе 24-48-часового культивирования. Тест EPISPOT позволил впервые получить подтверждение клинической значимости жизнеспособных ЦОК при РМЖ [14]. Исследования, основанные на определении специфической для обнаружения жизнеспособных ЦОК матричной РНК также получили широкое распространение и рассматриваются как альтернатива иммунологическим исследованиям для идентификации ЦОК. Основанный на определении РНК коммерческий тест AdnaTest™ (AdnaGen) использует неколичественную обратно-транскриптазную ПЦР для идентификации клеток, которые экспрессируют специфичные для опухолей транскрипты генов. Метод разделения по градиенту плотности при помощи центрифугирования (Ficoll-Hypaque GE Healthcare) и последующего выделения технологией OncoQuick также позволяет получить ЦОК, но образующиеся клеточные фракции не обладают достаточной степенью чистоты, поэтому разработка данного метода продолжается [13]. Наконец, довольно широко используются фильтрационные методики. В последние годы в мире внедряется основанная на вакуумной фильтрации технология выделения ЦОК по размеру (ISET), которая характеризуется как исключительно высокой чувствительностью, так и достаточной для оценки морфологии клеток специфичностью. Методика основана на фильтрации крови пациентов через мембрану с заданными размерами пор (ISET - Isolation by Sizе of Tumor cells). Впервые в мировой литературе методика выделения, а также дальнейшей иммуноморфологической и молекулярно-генетической характеристики ЦОК ISET была описана коллективом авторов под руководством профессора P.Paterlini-Bréchot. Для анализа используется кровь пациентов в количестве от 1 до 10 мл, которая фильтруется через поликарбонатную мембрану с калиброванными цилиндрическими порами диаметром 8 мкм. После фильтрации мембрана высушивается, промывается и окрашивается. Окрашенные препараты анализируются врачом-цитологом с помощью светового микроскопа. Для установления злокачественной природы клетки требуется наличие не менее 4 из следующих 5 критериев: анизонуклеоз (отношение более 0,5), размер ядра более 16 мкм, нерегулярность ядерного контура, наличие клеточных комплексов, высокое нуклеарно-цитоплазматическое отношение. При отсутствии одного либо нескольких критериев клетка признается атипичной [15, 16]. ЦОК при РМЖ В 1990-е годы было показано, что ЦОК в крови у больных ранним (N0) РМЖ обнаруживаются в 30% случаев, больных местно-распространенным (N+) раком - 36%, у больных метастатическим раком - в 70% случаев. Выявление клеток в периферической крови не зависит от возраста, менструальной функции, стадии, гистологического типа опухоли, уровня экспрессии рецепторов прогестерона, c-erbB2, p53 и Ki67. Было продемонстрировано, что ЦОК являются прогностическим маркером раннего рецидива. Содержание ЦОК в крови изменяется в зависимости от эффективности проводимой терапии (были изучены режимы CMF, FEC, оценена эффективность доцетаксела, тамоксифена, летрозола). Получены данные, что оценка наличия/отсутствия ЦОК в крови может быть использована для мониторинга у больных, получающих системную химиотерапию. После завершения адъювантной химиотерапии в крови больных РМЖ I и II стадий в 30% определяются циркулирующие СК19(+) клетки. У этих больных риск рецидива оказался выше в 3,8 раза, а безрецидивный интервал короче - ожидаемая частота рецидива составила 70% [6, 17]. Рядом исследователей также было показано, что содержание ЦОК в периферической крови изменяется в зависимости от эффективности проводимой химио- или гормонотерапии. В работе N.Xenidis и соавт. изучали наличие ЦОК (экспрессирующих матричную РНК CK-19) у 119 больных ранним РМЖ на фоне применения адъювантной химиотерапии и гормонотерапии (тамоксифен) [18]. После завершения адъювантной химиотерапии у 22 (18,5%) человек определялись ЦОК, причем у 15 из них терапия тамоксифеном не привела к элиминации ЦОК. Из этих 15 ЦОК-позитивных больных рецидив РМЖ возник у 7 (46,7%), тогда как среди 68 больных без ЦОК на обоих этапах лечения - только у 6 (8,8%). Персистенция ЦОК коррелировала с более низкой медианой безрецидивной и общей выживаемости. При многофакторном анализе выявлено, что обнаружение ЦОК во время лечения тамоксифеном ассоциировано с повышенным риском рецидива. В другом исследовании ЦОК в периферической крови определялись более чем у 1/2 больных распространенным РМЖ, а их количество изменялось в зависимости от эффективности проводимой химио- или гормонотерапии (были изучены схемы CMF, FEC, таксотер, тамоксифен, анастрозол) [19]. В 2004 г. M.Cristofanilli и соавт. провели основополагающее исследование у больных РМЖ. Было показано, что циркулирующие эпителиальные клетки, обнаруженные с помощью CellSearch, практически не встречались у здоровых женщин и у пациентов с доброкачественным заболеванием молочной железы. Был также установлен пороговый уровень ЦОК в крови, имеющий прогностическое значение при диссеминированном РМЖ. Больные диссеминированным РМЖ с количеством ЦОК менее 5 на 7,5 мл крови имели большую общую продолжительность жизни (18 и 10,1 мес) и более длительный безрецидивный интервал (7,0 и 2,7 мес) по сравнению с больными, у которых число ЦОК было больше [20]. J.Gafforio и соавт. было выполнено исследование ЦОК в периферической крови у больных РМЖ до начала химиотерапии, определена корреляция между выявленными опухолевыми клетками, экспрессией рецепторов к эстрогенам и статусом регионарных лимфатических узлов [21]. Российскими исследователями под руководством профессора С.А.Тюляндина показано, что ЦОК выявляются у 41,3% больных распространенным РМЖ в количестве не менее 1 клетки на 1 млн. Количество ЦОК не зависит от локализации и количества метастазов, а также от рецепторного статуса первичной опухоли молочной железы. ЦОК чаще выявляются у больных в менопаузе, чем в пременопаузе (47,8 и 26,7%, р=0,044). У больных инфильтративно-дольковым РМЖ ЦОК обнаруживаются достоверно чаще, чем у больных инфильтративно-протоковым РМЖ (69,2 и 31%, р=0,02) [22]. Особый интерес представляют работы по изучению ЦОК в крови на ранних стадиях рака. Обнаружение клеток у таких больных может привести к существенному изменению тактики лечения. S.Apostolaki и соавт. в 2007 г. проанализировали клиническое значение ЦОК у 214 больных операбельным РМЖ I-II стадии на фоне адъювантной химиотерапии. Элиминация ЦОК после адъювантной химиотерапии наблюдалась только у 30,2% больных. Обнаружение ЦОК после химиотерапии коррелировало с уменьшением безрецидивной выживаемости и служило независимым фактором неблагоприятного прогноза [23]. F.Bidard и соавт. провели исследование ЦОК у больных ранним РМЖ. Наличие одной и более ЦОК в 7,5 мл крови (по методике CellSearch) являлось независимым фактором неблагоприятного прогноза. Авторы отметили, что наиболее значимую прогностическую роль играет определение ЦОК до проведения неоадъювантной химиотерапии [24]. Интересны исследования по определению ЦОК в крови больных операбельным РМЖ в процессе неоадъювантной химиотерапии. Наиболее крупные из них: GEPARQUINTO, GeparQuattro, REMAGUS02, Gunma Hospital, BEVERLY01, NEOAVA, NEOZOTAC, NEOALLTO [25]. В исследовании GeparQuattro получены данные, свидетельствующие о том, что современные схемы химиотерапии не могут обеспечить полную элиминацию ЦОК у больных операбельным раком. Было продемонстрировано, что частота определения ЦОК после проведения неоадъювантной химиотерапии снижается с 22 до 11%. Также отмечено уменьшение количества клеток в 7,5 мл на фоне проводимой химиотерапии. [26]. Вместе с тем выявление ЦОК в периферической крови больных РМЖ перед началом химиотерапии коррелирует как с безрецидивной, так и с общей продолжительностью жизни. O.Camara и соавт. проанализировали значение ЦОК для оценки эффективности проводимой неоадъювантной химиотерапии у больных РМЖ. После проведения первых циклов химиотерапии ЦОК определялись у подавляющего большинства больных независимо от схемы лечения, тогда как количество ЦОК уменьшалось при добавлении схемы CMF (циклофосфамид, метотрексат, 5-фторурацил). Плохой ответ опухоли коррелировал с ранним развитием рецидива [27]. Ни одно из исследований ЦОК в процессе неоадъювантной химиотерапии не показало корреляции со степенью патоморфологического ответа [25]. На протяжении 20 лет I.Alpers и В.Brandt изучали прогностическое значение HER2-положительных ЦОК у больных РМЖ, используя метод, основанный на градиенте плотности и иммуномагнитной сепарации с последующим проведением иммуноцитохимического анализа. Примерно у 50% больных РМЖ без макрометастазов было выявлено от 1 до 8 кластеров ЦОК, у первичных метастатических больных и женщин с инфильтративно-отечной формой рака HER2-положительные ЦОК обнаруживались в 100% случаев. Наличие и частота HER2-положительных ЦОК коррелировали с достоверным снижением безрецидивной и общей выживаемости. Авторы предположили существование вероятности того, что высокие уровни HER2-положительных ЦОК отражают активность опухоли и могут служить прогностическим фактором эффективности трастузумаба. Они показали статистически достоверную связь наличия HER-положительных ЦОК с большим размером опухоли (показатель рТ), отрицательным статусом эстрогеновых рецепторов, более низкой степенью дифференцировки и инвазией лимфатических сосудов, отсутствие статистически значимых корреляций со статусом лимфоузлов (показатель pN), статусом рецепторов прогестерона и индексом пролиферации (Ki67). Наличие HER2-положительных ЦОК у больных РМЖ без метастазов может быть специфическим индикатором микрометастазов, выявление HER2-положительных ЦОК позволит проводить оценку статуса HER2 в режиме реального времени на протяжении всего клинического течения болезни [28]. Имеются сообщения о том, что у значительного процента больных с HER2-отрицательными первичными опухолями в процессе прогрессирования заболевания в сыворотке определяются высокие уровни HER2, что подтверждает возможность появления генной амплификации в ходе развития заболевания [29, 30]. Обнаружение микрометастазов в костном мозге и периферической крови у больных РМЖ достоверно коррелирует с меньшей безрецидивной и общей выживаемостью, а также с ранним рецидивом, причем при увеличении содержания опухолевых клеток риск рецидива возрастает. Исследование ЦОК может способствовать обнаружению новых мишеней для таргетной терапии, а также мониторингу эффективности проводимой лекарственной терапии в режиме реального времени [31]. Результаты некоторых клинических исследований, посвященных анализу ЦОК при РМЖ, приведены в таблице. Заключение Клинические результаты анализа ЦОК у больных РМЖ в высокой степени зависят от использованной технологии. На сегодняшний день не существует единой стандартизированной методики анализа ЦОК. Наиболее часто применяются иммуномагнитные и иммунофлюоресцентные методики. Перспективны фильтрационные методы выделения ЦОК и методика EPISPOT. Наличие ЦОК в крови свидетельствует о приобретении опухолью принципиально новых качеств - инвазивности и способности к метастазированию. Мы считаем, что ЦОК - это не только ключ к пониманию биологии метастазов, но и прогностический и предиктивный онкомаркер нового поколения. Выявление ЦОК при раннем РМЖ является независимым прогностическим фактором рецидива заболевания. ЦОК могут использоваться для мониторинга эффективности нео- и адъювантной терапии, являться маркером дискордантности первичной опухоли и возникающих в случае прогрессирования заболевания метастатических очагов. Определение ЦОК при метастатическом РМЖ, возможно, вытеснит из клинической практики повторные инвазивные биопсии с целью верификации иммунофенотипа новых очагов заболевания, приведет к расширению возможностей использования таргетной терапии.

About the authors

Yu N Nenahova

Russian Medical Academy for Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: lyullikalya@mail.ru
125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1

V K Lyadov

Russian Medical Academy for Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation; Medical and Rehabilitation Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1; 125367, Russian Federation, Moscow, Ivan’kovskoe sh., d. 3

I V Poddubnaya

Russian Medical Academy for Postgraduate Education of the Ministry of Health of the Russian Federation; N.N.Blokhin Russian Cancer Reseach Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

125993, Russian Federation, Moscow, ul. Barrikadnaia, d. 2/1; 115478, Russian Federation, Moscow, Kashirskoe sh., d. 23

References

Supplementary files