Current possibilities in diagnosis and treatment of diffuse large B cell lymphoma in children and adolescents: results of Pediatric Hematology and Oncology Research Institute of N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center, international experience

Full Text

Введение Диффузная В-крупноклеточная лимфома (ДВККЛ) представляет собой зрелоклеточную В-клеточную лимфому и составляет 10-15% от всех неходжкинских лимфом в детском возрасте, 7% - у детей до 15 лет, 15% - у детей старше 15 лет, 30-40% - у взрослых пациентов [1-3]. В соответствии с классификацией опухолей гемопоэтической и лимфоидной ткани Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2008 г. ДВККЛ представлена 3 морфологическими вариантами: центробластным, иммунобластным, анапластическим; 2 молекулярными подгруппами: GCB (germinal centre B-cell like) - подобный В-клеткам герминального происхождения; АВС (activated B-cell like) - подобный активированным В-клеткам; 2 иммуногистохимическими (ИГХ) подгруппами: GCB (germinal centre B-cell like); non-GCB (non-germinal centre B- cell like). Для ДВККЛ характерен иммунофенотип: экспрессия CD20 - в 100% случаев, CD10 - 68%, BCL2 - 40%, BCL6 - 90%, MUM1 - 60%, Ki67 - 70-95%, ALK и CD5 - в единичных случаях. Транслокация t(14;18) (q32;q21)/IGH-BCL2 у детей практически не встречается [4-7]. По данным исследований B-NHL-BFM (Berlin-Frankfurt-Munster) и FAB/LMB (French-American-British Mature B- Cell Lymphoma) групп, преобладающим морфологическим вариантом ДВККЛ является центробластный (76%), в соответствии с диагностическим алгоритмом Hans GCB вариант ДBККЛ встречается у 57-83% детей, non- GCB - 17-43% [5, 6, 8, 9]. Ведущую роль в патогенезе GCB варианта ДВККЛ играют AKT/mTOR, MYC/BCL2/BCL6 ассоциированные сигнальные пути. Патогенез non-GCB варианта ДВККЛ связан с изменениями нуклеарного фактора kB, MYC, BCL6 ассоциированных сигнальных путей [10, 11]. В клинической картине в 1/2 случаев выявляются локализованные формы ДBККЛ на I-II стадиях заболевания. Поражение периферических лимфатических узлов отмечено в 70% случаев. Вовлечение лимфатических узлов средостения отмечено в 15-20% случаев, лимфатических узлов брюшной полости - 20%, лимфатических узлов забрюшинного пространства - 20-24%, носоглотки, ротоглотки, костей - 11%. На момент диагностики заболевания В-симптомы присутствуют у 15-26% больных. У 41% пациентов определяется III стадия заболевания, IV - у 4%, преимущественно у пациентов с иммунобластным вариантом ДBККЛ. Поражение костного мозга и центральной нервной системы (ЦНС) выявляется преимущественно у пациентов с иммунобластным вариантом и составляет 6% [2, 5, 12, 13]. Совершенствование режимов полихимиотерапии ДВККЛ в детской онкогематологии шло по пути интенсификации режимов и создания протоколов риск-адаптированного лечения. Данный подход привел к тому, что в настоящее время 4-5-летняя общая (ОВ) и бессобытийная выживаемость (БСВ) у пациентов с I- IV стадиями, R1-R4 группами риска, получивших лечение по программам B-NHL-BFM90, B-NHL-BFM95, FAB/LMB96, BNHL03, FAB/LMB96 + ритуксимаб (COGANHL01P1), B-НХЛ2004м + ритуксимаб, составляет 93- 95% [2, 5, 14-20]. При появлении программ FAB/LMB96 ± ритуксимаб и B-NHL-BFM04 + ритуксимаб появилась тенденция к снижению интенсивности проводимой полихимиотерапии; однако важно отметить, что это требует совершенствования критериев стратификации групп риска с учетом молекулярной биологии опухоли, включая определение чувствительности к препаратам анти-CD20 моноклональных антител. Среди исследовательских групп, занимающихся вопросами диагностики и лечения лимфом у детей, BFM- группа в 2006 г. одной из первых представила результаты исследований В-NHL-BFM90 и В-NHL-BFM95 по определению частоты встречаемости GCB и non-GCB ИГХ-вариантов ДВККЛ с учетом диагностического алгоритма Hans. В исследование включены 63 ребенка. Пациенты с III-IV стадиями заболевания составили 50%. GCB вариант выявлен у 83% пациентов, non-GCB - у 17%. Изучалась экспрессия CD10, которая была обнаружена в 68% случаев ДВККЛ, BCL2 - 40%, BCL6 - 90%, MUM1 - 60%. Существенной разницы в 5- летней БСВ у детей в группах GCB (43 пациента) и non-GCB (9 пациентов) не отмечено: 93 и 89% соответственно. Не было выявлено статистически достоверного значения экспрессии BCL2, BCL6 и MUM1 для выживаемости детей с ДВККЛ [5, 21]. Y.Chen и соавт. опубликовали результаты исследования по определению частоты встречаемости GCB и non- GCB вариантов ДВККЛ у 50 детей, получивших лечение по программам В-NHL-BFM90, В-NHL-BFM95 за период с 2000 по 2011 г. В соответствии с диагностическим алгоритмом Hans GCB выявлен у 26 (57,8%), а non-GCB - у 19 (42,2%). Преобладали пациенты с III-IV стадиями заболевания (63%). При этом 4-летняя БСВ в группе GCB составила 88%, в группе non-GCB - 92,9%. При анализе прогностического влияния экспрессии BCL2, BCL6 и MUM1 на показатели выживаемости детей с ДВККЛ достоверных различий получено не было [22]. R.Miles и соавт. представили результаты по определению частоты встречаемости GCB и non-GCB вариантов ДВККЛ у 70 детей, получивших лечение по протоколу FAB/LMB96 за период с 1996 по 2001 г. В соответствии с диагностическим алгоритмом Hans GCB вариант выявлен у 59 (84%), а non-GCB - у 11 (16%). При этом 3летняя БСВ в группе GCB составила 91%, в группе non-GCB - 64%. Однако нужно отметить, что все пациенты с non-GCB вариантом были включены в терапевтические группы В и С, у 6 детей отмечалось поражение средостения, у 1 - поражение ЦНС, в то время как терапевтические группы В и С у детей с GCB вариантом ДВККЛ были выявлены в 64% случаев. При проведении ИГХ-исследования экспрессия протеина MYC была выявлена у 21 (88%) из 24 пациентов с GCB вариантом ДВККЛ, у 2 из 2 пациентов - с non-GCB вариантом (уровень экспрессии не оценивался); BCL6-позитивный вариант ДВККЛ - у 10 из 19 (55%), BCL2-позитивный - у 17 из 64 (29%). В 11 случаях с поражением средостения был выявлен MUM1-позитивный вариант ДВККЛ. Значение экспрессии BCL2, BCL6 и MUM1 для выживаемости детей с ДВККЛ в данном исследовании не оценивалось. H.Poirel и соавт. проанализировали цитогенетические изменения в группе из 30 детей с ДВККЛ, также получивших лечение по программе FAB/LMB96. Реаранжировка 8q24 выявлена в 33% случаев. Во всех случаях с реаранжировкой 8q24 отмечены другие цитогенетические аномалии. Анеуплоидия и комплексность (более 1 генетической аномалии) выявлены в 80% случаев, делеция 6q - 40%. Установлено влияние наличия реаранжировки 8q24 на 5-летнюю БСВ (100% - без реаранжировки 8q24, 50% - с реаранжировкой 8q24, p<0,05) [9, 23]. Во всех протоколах B-NHL-BFM90, B-NHL-BFM95, FAB/LMB96, R-FAB/LMB96 и R-B-NHL-BFM04 для определения GCB/non-GCB вариантов ДВККЛ применялся трехпараметрический диагностический алгоритм Hans [17, 20, 24, 25]. В последние годы у взрослых пациентов широкую известность получили диагностические алгоритмы Tally и Visco-Young. В исследовательских работах R.Culpin и P.Meyer были показаны более высокая чувствительность и специфичность диагностического алгоритма Tally в сравнении с алгоритмом Hans (86 и 82% - чувствительность, 99 и 90% - специфичность). У детей подобных исследований не проводилось [26- 29]. Интересно отметить, что у взрослых пациентов в соответствии с результатами международной программы R- CHOP (International DLBCL Rituximab-CHOP consortium program) выявлены морфоиммунологические факторы неблагоприятного прогноза заболевания: non-GCB вариант ДВККЛ, высокий уровень экспрессии протеина MYC (более 50%), коэкспрессия MYC/BCL2, низкий уровень экспрессии BCL6 (менее 25%), CD30-негативный вариант ДВККЛ, HLA-DR-негативный вариант ДВККЛ, высокий уровень ядерной экспрессии STAT3 - более 75%, экспрессии p-STAT3 - более 50%, экспрессии BACH2, коэкспрессия MYC, BCL2 c p-STAT3 и BACH2, CD5-позитивный вариант ДВККЛ, ALK-позитивный вариант ДВККЛ, MYC single/double/triple-hit варианты ДВККЛ, иммуноглобулин (Ig)M-секретирующий вариант ДВККЛ, низкий уровень CD68+ клеток (М1-тип макрофагов) и высокий уровень CD163+ клеток (М2-тип макрофагов) в опухолевом субстрате [30-44]. Влияние данных факторов на выживаемость у детей требует дополнительного изучения. Материалы и методы В исследование включен 51 пациент с впервые диагностированной ДВККЛ в возрастной группе до 18 лет. Пациентам проводилось программное лечение по протоколам IDM-NHL-BFM90, B-NHL-BFM95, B-NHL-BFM95 + ритуксимаб в НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России. Диагностика заболевания проведена с учетом клинической картины, данных клинических анализов, инструментальных методов исследования, гистологического исследования, ИГХ-исследования и/или проточной цитометрии (ПЦМ), цитогенетического исследования. Стадия заболевания определялась в соответствии с критериями St. Jude (Murphy) и International Pediatric Non- Hodgkin Lymphoma Staging System [45, 46]. Для определения объема распространения опухоли применялись инструментальные методы диагностики: ультразвуковое исследование органов средостения, периферических лимфатических узлов, органов брюшной полости, забрюшинного пространства, малого таза; рентгенография органов грудной полости, костей; компьютерно-томографическое исследование придаточных пазух носа, органов грудной полости, брюшной полости, забрюшинного пространства, малого таза с внутривенным контрастированием; радиоизотопное исследование с 67Ga (галлием-67), 99mTc-технефор (технецием-99m), позитронно- эмиссионно-/компьютерно-томографическое исследование с 18F-фтордезоксиглюкозой [47-50]. Стратификация групп риска в соответствии с протоколом IDM-NHL-BFM90: R1 - опухоль полностью резецирована; R2 - нерезецированная опухоль, лактатдегидрогеназа (ЛДГ)<500 ЕД/л или локализация опухоли за пределами брюшной полости; R3 - опухолевое поражение органов брюшной полости, ЛДГ>500 ЕД/л, или поражение костного мозга, или поражение ЦНС, или множественное поражение костей [24, 51]. Стратификация по группам риска в соответствии с протоколом В-NHL-BFM95 ± ритуксимаб: R1 - I и II стадии заболевания, опухоль резецирована; R2 - I и II стадии заболевания с нерезецированной опухолью, III стадия заболевания, ЛДГ<500 ЕД/л; R3 - III стадия заболевания, ЛДГ 500-1000 ЕД/л, IV стадия заболевания (поражение костного мозга, ЛДГ<1000 ЕД/л); R4 - III-IV стадии заболевания, поражение костного мозга, ЛДГ>1000 ЕД/л и/или ЦНС-позитивный статус [25]. Диагноз у пациентов, получивших лечение по программам терапии IDM-NHL-BFM90, В-NHL-BFM95 ± ритуксимаб, установлен в соответствии с классификациями опухолей гемопоэтической и лимфоидной ткани Kiel, REAL и ВОЗ 2001, 2008 гг. [4]. Для проведения ПЦМ и ИГХ-исследования использовались антитела: CD3, CD5, CD10, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD38, CD44, CD45, CD79a, HLA-DR, ALK, Ki67, BCL2, BCL6, PAX5, TdT, FOXP1, GCET1, LMO2, TRAF1, TNFAIP2, STAT3, pSTAT3, C-MYC. Положительный результат определялся при уровне экспрессии (%): CD10>30, CD20>20, CD30>20, EMA>25, BCL2>70, BCL6>30, MUM1>60, FOXP1>60, GCET1>60, LMO2>30, TRAF1>50, TNFAIP2>50, STAT3>20, pSTAT3>50, C-MYC>40. Для ИГХ-диагностики GCB и non-GCB вариантов ДВККЛ применялись 3 диагностических алгоритма: Hans, Tally, Visco-Young. Определение принадлежности ДВККЛ к GCB и non-GCB варианту в соответствии с диагностическим алгоритмом Hans проведено у 24 (47,1%) пациентов [17, 20]. Диагностический алгоритм Tally, в котором оцениваются 5 ИГХ-маркеров: CD10, GCET1, MUM1, FOXP1, LMO2, - использовался у 11 (21,6%) детей [26, 27]. Трехпараметрический диагностический алгоритм Visco-Young, в котором оцениваются 3 ИГХ-маркера: CD10, FOXP1, BCL6, - использовался у 23 (45,1%) пациентов [29]. Применялись 2 ИГХ-алгоритма, которые с большей степенью вероятности отражают наличие реаранжировки MYC: иммунофенотип опухоли TCL1+, CD38+, CD44- или CD38+, CD44- [52]; уровень экспрессии протеина MYC выше 70% (чувствительность метода 100%, специфичность 93%) [53]. Маркеры TRAF1, TNFAIP2 использовались для проведения дифференциального диагноза между ДВККЛ с поражением средостения и первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомой (ПМВККЛ) [54]. Для выявления наличия реаранжировки и/или амплификации гена C-MYC, реаранжировки генов BCL2, BCL6 проведено FISH (Fluorescence in situ Hybridization) исследование с применением ДНК-зондов: MYC (8q24) Break probe, triple color; MYC (8q24), SE8 Control probe; BCL2 (18q21) Break probe, dual color; BCL6 (3q27) Break probe, dual color (Repeat-freeTM PoseidonTM, KREATECH). Протокол IDM-NHL-BFM90 применялся в НИИ ДОГ для лечения ДВККЛ с 1994 по 2003 г. Терапия ДВККЛ в зависимости от группы риска: R1 - циторедуктивная фаза, блоки А, В; R2 - циторедуктивная фаза, блоки АA, ВB. При полном ответе на лечение после 2 курсов - АА, ВВ; при частичном - СС, АА, ВВ, СС; R3 - циторедуктивная фаза, блоки АА, ВВ. При полном ответе после 2 курсов - АА, ВВ, АА, ВВ; при частичном - СС, АА, ВВ, СС. Особенностью данного протокола является снижение дозы метотрексата в блоках химиотерапии АА и ВВ с 5000 до 1000 мг/м2 (IDM) внутривенно капельно в течение 24 ч, 1-й день. Протокол В-NHL-BFM95 применялся в НИИ ДОГ для лечения детей с ДBККЛ с 2003 по 2015 г. Программа терапии В-NHL-BFM95 проведена 24 пациентам с ДВККЛ. Терапия ДВККЛ в зависимости от группы риска: R1 - циторедуктивная фаза, блоки А, В; R2 - циторедуктивная фаза, блоки А, В, А, В; R3 - циторедуктивная фаза, блоки АA, ВB, CC, АA, ВB; R4 - циторедуктивная фаза, блоки АA, ВB, CC, АA, ВB, CC. В соответствии с протоколом блок А соответствует блоку IDM-AA программы IDM-NHL-BFM90, блок В соответствует блоку IDM-BB программы IDM-NHL-BFM90. В сравнении с программой IDM-NHL-BFM90 отличительной особенностью блоков АА и ВВ было применение метотрексата в дозе 5000 мг/м2 внутривенно капельно в течение 24 ч, 1-й день. Отличительной особенностью блока СС явилось применение цитарабина в разовой дозе 3000 мг/м2 (разовая доза цитарабина в блоке СС прораммы IDM-NHL-BFM90 2000 мг/м2) внутривенно капельно в течение 3 ч, 1-2-й дни, 4 введения с интервалом 12 ч [25]. Протокол В-NHL-BFM95 + ритуксимаб применялся в НИИ ДОГ для лечения ДВККЛ у детей с III-IV стадиями заболевания, R3-R4 группами риска с 2007 по 2015 г. Программа терапии В-NHL-BFM95 + ритуксимаб проведена 7 пациентам с ДBККЛ. В соответствии с программой ритуксимаб вводился в дозе 375 мг/м2 за 24 ч до начала блоков АА, ВВ, СС. Статистический анализ проведен с использованием статистического пакета IBM-SPSS Statistics 21. Оценка параметрических данных проведена посредством сравнения средних величин с использованием критерия Стьюдента. Непараметрические данные сравнивались по критерию c2 Пирсона при помощи построения таблиц сопряженности признаков. Выживаемость больных оценена посредством построения кривых с помощью метода Kaplan-Meier. Значимость различий между кривыми выживаемости оценивалась по методу log-rank. Полный ответ (полная ремиссия) - отсутствие признаков опухолевого роста в течение 1 мес после достижения полного эффекта (отсутствия признаков остаточной опухоли в зонах поражения, выявленных при первичной диагностике). Частичный ответ (неполная ремиссия) - сохраняются признаки остаточной опухоли после завершенного программного лечения в зонах поражения, выявленных при первичной диагностике. ОВ считается от начала лечения до окончания исследования (05.10.2015) или смерти больного. БСВ рассчитывалась от даты начала лечения до любого события (прогрессирование во время лечения, отсутствие ремиссии после завершения лечения, осложнения, вызвавшие прекращение лечения, рецидив, смерть от любой причины) или до окончания исследования (05.10.2015). Безрецидивная выживаемость (БРВ) - от момента наступления ремиссии до момента возникновения рецидива (оценивалась у пациентов, завершивших полное программное лечение). Результаты Клиническая характеристика пациентов В исследование включен 51 ребенок с диагнозом ДВККЛ, 33 (64,7%) мальчика и 18 (35,3%) девочек. В возрастной группе до 14 лет - 39 (76,4%) детей, старше 14 лет - 12 (23,6%) детей. Средний возраст 9,9±0,5 года, медиана возраста 10 лет, минимальный возраст 2 года. С I стадией - 8 (15,7%) детей, II - 14 (27,5%), III 17 (33,3%), IV - 12 (23,5%). С III и IV стадиями заболевания - 29 (56,8%) пациентов. В клинической картине заболевания В-симптомы встречались у 25 (49%) больных, поражение лимфатических узлов средостения - в 10 (19,6%) случаях; (поперечный размер конгломерата менее 10 см в 8 случаях, более 10 см - в 2), синдром верхней полой вены - 6 (11,7%), поражение легких - 7 (13,7%), плеврит - 7 (13,7%), поражение лимфатических узлов брюшной полости - 12 (23,5%), лимфатических узлов забрюшинного пространства - 13 (25,5%), периферических лимфатических узлов выше диафрагмы - 31 (60,8%), периферических лимфатических узлов ниже диафрагмы - 6 (11,8%), мягких тканей - 10 (19,6%), костей - 12 (23,5%), кожи - 2 (3,9%), носоглотки - 11 (21,6%), придаточных пазух носа - 3 (5,8%), ротоглотки - 12 (23,5%), лимфоэпителиального кольца - 13 (25,5%), опухоль параменингеальной локализации - 4 (7,8%), поражение кишечника - 8 (15,7%), асцит - 6 (11,8%), гепатомегалия - 6 (11,8%), поражение почек - 3 (5,8%), поражения ЦНС, яичка, молочной железы, опухоль интрапаравертебральной локализации, спленомегалия отмечены в единичных случаях. Поражение костного мозга не было выявлено. В соответствии с данными клинических анализов крови уровень ЛДГ<500 ЕД/л выявлен у 27 (52,9%) пациентов, от 500 до 1000 ЕД/л - 18 (35,3%), больше 1000 ЕД/л - 6 (11,8%). Гистологическое исследование, ПЦМ, ИГХ и цитогенетическое исследования у пациентов с ДВККЛ Гистологическое исследование проведено у всех пациентов. ПЦМ выполнена у 42 (82,4%) пациентов, ИГХ- исследование - 24 (47,1%). ИГХ-исследование и ПЦМ выполнены у 15 (29,4%). CD19-позитивный вариант ДВККЛ выявлен у 30 (96,8%) из 31, CD20-позитивный вариант ДВККЛ - у всех пациентов (100%). BCL2-позитивный вариант ДВККЛ выявлен у 9 (40,9%) из 22 детей. BCL6-позитивный вариант ДВККЛ выявлен у 15 (88,2%) из 17 детей. C-MYC позитивный статус ДВККЛ - у 10 (62,5%) из 16 пациентов. HLA-DR-позитивный вариант ДВККЛ - у 14 (82,4%) из 17 пациентов. Все пациенты - c CD5 и ALK- негативным вариантом ДВККЛ. Для ИГХ-диагностики GCB и non-GCB вариантов ДВККЛ применялись три диагностических алгоритма: Hans, Tally, Visco-Young. GCB вариант ДВККЛ выявлен у 13 (54,2%) детей, non-GCB - 11 (45,8%). В соответствии с диагностическими алгоритмами Hans GCB вариант ДВККЛ обнаружен у 10 (41,7%) из 24 пациентов, Tally - 7 (63,6%) из 11 пациентов, Visco-Young - 10 (43,5%) из 23 пациентов. Был отмечен тренд различия в выявлении GCB/non-GCB вариантов ДВККЛ при использовании диагностических алгоритмов Hans, Tally, Visco-Young (у 3 пациентов выявлен GCB вариант ДВККЛ в соответствии с алгоритмом Tally, non-GCB - в соответствии с алгоритмами Hans, Visco-Young; р=0,058). Комплексное ИГХ и цитогенетическое исследования выполнены преимущественно у пациентов, получивших лечение по программам В-NHL-BFM95 и В-NHL-BFM95 + ритуксимаб. При этом CD20-позитивный вариант ДВККЛ выявлен у всех пациентов (100%). У 15 пациентов, которым проведены ПЦМ и ИГХ-исследование, выявлены мембранная и цитоплазматическая экспрессии CD20. CD20 ПЦМ-негативных вариантов ДВККЛ не обнаружено. Экспрессия CD19 - у 17 (94,4%) из 18, CD10 - 10 (41,7%) из 24, CD23 - 1 (7,1%) из 14, CD30 - 2 (16,7%) из 12, CD45 - 15 (100%) из 15. GCB вариант ДВККЛ выявлен у 11 (50%) детей, non-GCB - 11 (50%) в соответствии с диагностическими алгоритмами Hans, Tally, Visco- Young. CD38, CD44 статус опухоли оценивался у 10 (32,2%) детей, C-MYC статус ДВККЛ - у 14 (46,7%). CD38+, CD44- вариант ДВККЛ выявлен у 3 из 10 детей. C-MYC-позитивный статус ДВККЛ выявлен у 10 (71,4%) из 14 пациентов. Уровень экспрессии протеина С-MYC выше 70% в опухоли у 7 (70%) из 10 детей. При этом в группе из 6 пациентов с III-IV стадиями, R3-R4 группами риска, у 3 пациентов с уровнем экспрессии С-MYC в опухолевом субстрате более 70% выявлена реаранжировка гена C-MYC, у 3 пациентов с уровнем экспрессии С-MYC в опухолевом субстрате менее 70% реаранжировки гена C-MYC не выявлено (50 и 50%, р=0,014). Иммунофенотип опухоли с реаранжировкой гена C-MYC: CD38+, CD44-, уровень экспрессии С-MYC>70%. BCL2-позитивный вариант ДВККЛ выявлен у 8 (40%) из 20 детей. Коэкспрессия BCL2/CMYC в опухоли - только у 2 (18,2%) из 11 пациентов. Реаранжировки гена C-MYC у пациентов с коэкспрессией BCL2/CMYC в опухоли не обнаружено. BCL6-позитивный вариант ДВККЛ у 15 (93,8%) из 16, FOXP1 - 10 (76,9%) из 13, GCET1 - 5 (55,6%) из 9, MUM1 - 12 (70,5%) из 17, LMO2 - 4 (50%) из 8, РАХ5 - 7 (87,5%) из 8. Уровень Ki67>80% выявлен у 15 (75%) из 20 пациентов. STAT3-позитивный вариант ДВККЛ выявлен у 3 (27,3%) из 11 детей, pSTAT3-позитивный - 1 (9,1%) из 11. Маркеры TRAF1, TNFAIP2 использовались для проведения дифференциального диагноза между ДВККЛ с поражением средостения и ПМВККЛ у 4 пациентов. При этом опухолевый субстрат был TRAF1, TNFAIP2- негативным. При проведении FISH-исследования реаранжировка гена c-MYC выявлена в опухоли у 3 (20%) из 15 детей. Реаранжировки генов BCL2, BCL6, Double-hit BCL2/CMYC вариант ДВККЛ, Triple-hit BCL2/BCL6/CMYC вариант ДВККЛ не обнаружены. Следовательно, характерными особенностями «молекулярного портрета» ДВККЛ являются экспрессия CD20 у всех пациентов, высокие уровни экспрессии CD19, CD38, CD45, HLA-DR, PAX5, BCL6, FOXP1, MUM1, C- MYC; соотношение GCB и non-GCB вариантов ДВККЛ составляет 1,1:1, наличие коэкспрессии BCL2/C-MYC и реаранжировки гена C-MYC - в единичных случаях. В группе пациентов, получивших лечение по программам В-NHL-BFM95 и B-NHL-BFM95 + ритуксимаб, выявлена статистически достоверная взаимосвязь между III- IV стадиями заболевания и более высокой частотой встречаемости non-GCB варианта ДВККЛ (р=0,022), C- MYC-позитивного варианта ДВККЛ (р=0,04), наличием реаранжировки гена C-MYC (р=0,018); между R3-R4 группами риска и более высокой частотой встречаемости C-MYC-позитивного варианта ДВККЛ (р=0,04), наличием реаранжировки гена C-MYC (р=0,018). Частота встречаемости GCB/non-GCB вариантов ДВККЛ, C-MYC-позитивного варианта ДВККЛ, BCL2- позитивного варианта ДВККЛ, STAT3 и pSTAT3-позитивного вариантов ДВККЛ, CD30-позитивного варианта ДВККЛ, коэкспрессии C-MYC/BCL2, реаранжировки C-MYC сопоставима с результатами международного исследования International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program у взрослых пациентов(табл. 1) [31, 32]. Статистически достоверных взаимосвязей между возрастом, полом, локализацией опухолевых очагов и экспрессией ИГХ-маркеров не обнаружено (p>0,05). Таким образом, получены следующие данные: Характерными особенностями «молекулярного портрета» ДВККЛ являются экспрессия CD20 у всех пациентов, высокие уровни экспрессии CD19, CD38, CD45, HLA-DR, PAX5, BCL6, FOXP1, MUM1, C-MYC; соотношение GCB и non-GCB вариантов ДВККЛ составляет 1,1:1; коэкспрессия BCL2/C-MYC и реаранжировка гена C-MYC выявлены в единичных случаях. При сравнении результатов данного исследования с результатами International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program отмечено сходство морфоиммунологической картины ДВККЛ у детей и взрослых. При использовании диагностических алгоритмов Hans, Tally, Visco-Young выявлена разница в определении GCB/non-GCB вариантов ДВККЛ (при применении алгоритма Tally увеличивается частота выявления GCB варианта ДВККЛ, р=0,058). Отмечена статистически достоверная взаимосвязь между III-IV стадиями заболевания и более высокой частотой встречаемости non-GCB варианта ДВККЛ (р=0,022), C-MYC-позитивного варианта ДВККЛ (р=0,04), наличием реаранжировки гена C-MYC (р=0,018); между R3-R4 группами риска и более высокой частотой встречаемости C-MYC-позитивного варианта ДВККЛ (р=0,04), наличием реаранжировки гена C-MYC (р=0,018). Выявлена статистически достоверная взаимосвязь между наличием реаранжировки гена C-MYC и иммунофенотипом опухоли CD38+, CD44-, С-MYC>70% у пациентов с III-IV стадиями заболевания, R3-R4 группами риска. Непосредственные результаты лечения и выживаемости детей с ДВККЛ Частота достижения полного ответа в зависимости от программы терапии. Программное лечение по протоколам IDM-NHL-BFM90 и B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб проведено 51 пациенту. 46 (91,2%) пациентов достигли полного ответа после завершенного лечения: 18 (90%) детей при проведении программы IDM-NHL-BFM90, 28 (90,3%) детей при проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб. У пациентов с I-II стадиями заболевания, R2 группой риска полный ответ достигнут у всех пациентов (100%), до 3-го курса химиотерапии у 12 (80%) детей, после 3-го курса - 3 (20%), до 4-го курса - 13 (86,7%), после 4-го - 2 (13,3%). У пациентов с III-IV стадиями заболевания, R3-R4 группами риска полный ответ был достигнут у 21 (80,7%) ребенка, до 3- го курса - 4 (19%), после 3-го курса - 17 (81%), до 4-го курса - 6 (28,5%) детей, после 4-го курса - 15 (71,4%). Не было выявлено статистически достоверной разницы в частоте достижения полного ответа до 3 и 4-го курсов химиотерапии между программами IDM-NHL-BFM90 и B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб (р=0,149 и р=0,676). Пятеро (19,2%) пациентов не достигли полного ответа (3 - при проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб и 2 - при проведении программы IDM-NHL-BFM90, 3 - в связи с прогрессированием заболевания, 2 - в связи с инфекционной токсичностью). Показатели ОВ, БСВ и БРВ в зависимости от программы терапии (для всей группы пациентов). При проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб ОВ составила 90,3±5,3% при средней продолжительности наблюдения 63,3±7,9 мес, программы IDM-NHL-BFM90 - 85±8% при средней продолжительности наблюдения 174±15,4 мес (рис. 1). При проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб БСВ 90,3±5,3% при средней продолжительности наблюдения 63,3±7,9 мес, IDM-NHL-BFM90 - 75±9,7% при средней продолжительности наблюдения 153,7±19,6 мес (рис. 2). При проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб БРВ 100% при средней продолжительности наблюдения 69,5±7,9 мес, IDM-NHL-BFM90 - 83,3±8,8% при средней продолжительности наблюдения 170±17,8 мес (рис. 3). В группе пациентов с I-II стадиями заболевания (21 пациент) показатели ОВ, БСВ, БРВ составили 100% при средней продолжительности наблюдения 90,5±12,5 мес. При этом 17 пациентов получили лечение по программе B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб, 4 - по программе IDM-NHL-BFM90. Представлены результаты лечения детей с III-IV стадиями заболевания, R3-R4 группами риска, получивших лечение по программам IDM-NHL-BFM90, B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб. Группы пациентов статистически достоверно сопоставимы по полу, возрасту, объему поражения и биохимической активности опухоли (табл. 2). При проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб ОВ 75±12,5% при средней продолжительности наблюдения 52,9±15 мес, IDM-NHL-BFM90 - 78,6±11% при средней продолжительности наблюдения 169±21,6 мес (рис. 4). При проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб БСВ 75±12,5% при средней продолжительности наблюдения 52,9±15 мес, IDM-NHL-BFM90 - 64,3±12,8% при средней продолжительности наблюдения 139±27 мес (рис. 5). При проведении программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб БРВ 100% при средней продолжительности наблюдения 68,8±17 мес, IDM-NHL-BFM90 - 75±12,5% при средней продолжительности наблюдения 162±26,1 мес (рис. 6). При проведении программы B-NHL-BFM95 + ритуксимаб ОВ 85,7±13,2% при средней продолжительности наблюдения 53,1±17,5 мес, B-NHL-BFM95 - 60±21,9% при средней продолжительности наблюдения 63±35,1 мес, IDM-NHL-BFM90 - 78,6±11% при средней продолжительности наблюдения 169±21,6 мес (рис. 7). При проведении программы B-NHL-BFM95 + ритуксимаб БСВ 85,7±13,2% при средней продолжительности наблюдения 53,1±17,5 мес, B-NHL-BFM95 - 60±21,9% при средней продолжительности наблюдения 62±35,2 мес, IDM-NHL-BFM90 - 64,3±12,8% при средней продолжительности наблюдения 139±27 мес (рис. 8). При проведении программы B-NHL-BFM95 + ритуксимаб БРВ 100% при средней продолжительности наблюдения 61,1±18,5 мес, B-NHL-BFM95 - 100% при средней продолжительности наблюдения 120±27 мес, IDM-NHL-BFM90 - 75±12,5% при средней продолжительности наблюдения 162±26,1 мес (рис. 9). Структура событий при проведении программ терапии IDM-NHL-BFM90 и B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб представлена в табл. 3. События были выявлены у пациентов с IIIB-IVB стадиями, R3-R4 группами риска. В группе пациентов, получивших лечение по программе IDM-NHL-BFM90, выявлено 5 событий, которые представлены ранними рецидивами у 2 детей, поздним рецидивом - 1, прогрессией заболевания - 1 и смертью от инфекционных осложнений - 1. В группе пациентов, получивших лечение по программе B-NHL- BFM95, выявлены только 2 события - прогрессия заболевания у 1 ребенка и смерть от инфекционных осложнений у 1. В группе пациентов, получивших лечение по программе B-NHL-BFM95 + ритуксимаб, выявлено только 1 событие - прогрессирование заболевания на фоне лечения. Три пациента с ранним и поздним рецидивом достигли повторной ремиссии после терапии 2-й линии. При проведении риск-адаптированного программного лечения с применением высоких доз метотрексата, ритуксимаба (для пациентов с III-IV стадиями, R3-R4 группами риска) статистически достоверно удалось добиться более высокой БРВ, только для пациентов, получивших программное лечение в полном объеме (р=0,040), но не ОВ и БСВ. Не установлено статистически достоверного значения пола, возраста (до 14 и старше 14 лет), клинических факторов (поражение легких, лимфатических узлов средостения, кожи, костей, печени, селезенки), биологической активности опухоли (уровень ЛДГ), морфоиммунологических факторов (GCB/non-GCB варианты ДВККЛ, экспрессия CD23, CD30, HLA-DR, С-MYC, BCL-2, BCL-6, реаранжировка гена C-MYC), скорости достижения полного ответа (до 3 или 4-го курса химиотерапии, у пациентов с III-IV стадиями, R3-R4 группами риска) для показателей ОВ, БСВ, БРВ (р>0,05). Обсуждение результатов При проведении риск-адаптированной программы B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб ОВ 90,3±5,3%, БСВ 90,3±5,3% при средней продолжительности наблюдения 63,3±7,9 мес, БРВ 100% при средней продолжительности наблюдения 69,5±7,9 мес. В группе пациентов с III-IV стадиями заболевания, R3-R4 группами риска при проведении программы B-NHL- BFM95 + ритуксимаб ОВ 85,7±13,2%, БСВ 85,7±13,2% при средней продолжительности наблюдения 53,1±17,5 мес, БРВ 100% при средней продолжительности наблюдения 66±24,1 мес. При этом не выявлено статистически достоверного значения клинических факторов (поражение легких, лимфатических узлов средостения, кожи, костей, печени, селезенки), биологической активности опухоли (уровень ЛДГ), морфоиммунологических факторов (GCB/non-GCB варианты ДВККЛ, экспрессия CD23, CD30, С-MYC, BCL-2, BCL-6, реаранжировка гена C-MYC), а также скорости достижения полного ответа для показателей ОВ, БСВ, БРВ. Учитывая сходство морфоиммунологической картины ДВККЛ у детей и взрослых, которое было показано в данной работе при сравнении исследуемой группы детей, подростков с ДВККЛ и результатов International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program, можно говорить о возможной прогностической значимости non- GCB варианта ДВККЛ, экспрессии HLA-DR, CD23, CD30, С-MYC, BCL-2, BCL-6, реаранжировки гена C-MYC при уменьшении интенсивности программного лечения у части пациентов. Также в настоящее время происходит постоянное совершенствование таргетной терапии, которая применяется в лечении ДВККЛ. В данной исследовательской работе выявлены морфоиммунологические характеристики ДВККЛ, определяющие возможность применения таргетной терапии: CD19-позитивный вариант ДВККЛ - у 94,4% пациентов, CD20 - у 100% пациентов. Следовательно, открывается возможность применения препаратов моноклональных антител (анти-CD20 - ритуксимаб, офатумумаб, обинутузумаб); BiTE (блинатумомаб), TriMAB (FBTA05 - Lymphomun); анти-CD19, анти-CD20 CAR (Chimeric antigen receptor-modified) T-лимфоцитов. В соответствии с результатами международных исследований установлена группа факторов, определяющая чувствительность к анти-CD20 моноклональным антителам: характер экспрессии CD20 (мембранный и цитоплазматический) в опухолевых клетках [55]; наличие или отсутствие гиперэкспрессии CD59 в опухолевых клетках [56]; полиморфизм гена FCGR3A 158 V/F в мононуклеарах периферической крови [57]. Открывается возможность применения у пациентов с гиперэкспрессией CD59, c VV или V/F генотипом FCGR3A (non-GCB вариантом ДВККЛ) препарата обинутузумаб (Газива), обладающего преимущественно антитело- опосредованной клеточно-зависимой цитотоксичностью. Обинутузумаб представляет собой рекомбинантное, частично гуманизированное, анти-CD20 IgG1 моноклональное антитело 2-го типа с модифицированной схемой гликозилирования, обладающее высокой аффинностью к Fcg-рецептору [58]. Для пациентов с пониженной экспрессией CD59, с F/F генотипом FCGR3A (non-GCB вариантом ДВККЛ) целесообразно применять препарат офатумумаб (Арзерра), обладающий преимущественно антитело-опосредованной комплементзависимой цитотоксичностью. Офатумумаб (Арзерра) - полностью гуманизированное анти-CD20 IgG1 моноклональное антитело 1-го типа, специфически связывающееся с эпитопом, который включает и малую, и большую внеклеточные петли CD20, активируя систему комплемента [59]. В исследовании НИИ ДОГ B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб 15 пациентам проведено определение характера экспрессии CD20 в соответствии с данными иммуногистохимии (цитоплазматический характер экспрессии) и ПЦМ (мембранный характер экспрессии). У всех пациентов выявлен ИГХ/ПЦМ-позитивный статус, что свидетельствует о чувствительности опухоли к препаратам анти-CD20 моноклональных антител. У детей, получивших лечение по протоколам R-FAB/LMB96, R-B-NHL-BFM04 и НИИ ДОГ B-NHL-BFM95 ± ритуксимаб оценка экспрессии CD59 и полиморфизм гена FCGR3A 158 V/F не определялись. Совершенно новым направлением в развитии таргетной терапии ДВККЛ является применение BiTE, TriMAB и CART лимфоцитов. На объединенном съезде Американского общества гематологов в 2014 г. (ASH annual meeting 2014) A.Viardot и соавт. представили результаты II фазы клинических исcледований препарата блинатумомаб в лечении взрослых пациентов с рецидивом и рефрактерным течением ДВККЛ. При этом общая частота ответа составила 43% (9 из 21 пациента, 4 пациента с полным ответом, 5 пациентов с частичным ответом) [60]. Однако данный препарат следует применять у пациентов с CD19-позитивным вариантом ДВККЛ. Блинатумомаб (fusion protein, BiTE, bispecific T-cell engager) представляет собой комбинированный белок, состоящий из легких и тяжелых цепей FAB (fragment antigen binding) фрагментов Ig к CD19 и CD3, механизм действия которого реализуется через цитотоксический эффект активированных CD3-позитивных Т- лимфоцитов [61]. У детей данный препарат применяется при лечении рецидивов и рефрактерных форм В-клеточного острого лимфобластного лейкоза. Установлена доза препарата с оптимальным профилем токсичности 15 мг/м2 в сутки [62, 63]. F.Schuster и соавт. опубликовали результаты I фазы клинических исcследований препарата FBTA05 (Lymphomun) у детей с рефрактерным течением CD20-позитивных В-клеточных лимфом и лейкозов. FBTA05 (Lymphomun) представляет собой химерное трифункциональное биспецифичное анти-CD20, анти-CD3 антитело, содержащее в своей структуре FAB фрагмент к CD20, CD3 и Fc фрагмент IgG. Тройной механизм действия реализуется через 2-й тип иммунопатологических реакций (антителозависимую клеточно- опосредованную цитотоксичность через Fc фрагмент IgG, NK-клетки и CD8-позитивные лимфоциты, комплементзависимую антитело-опосредованную цитотоксичность через Fc фрагмент IgG и цитотоксический эффект за счет связывания с CD3-позитивными лимфоцитами). В исследование включены 3 пациента с ДВККЛ, 3 пациента с лимфомой Беркитта, 3 пациента с В-клеточным острым лимфобластным лейкозом. Всем пациентам с ДВККЛ до начала лечения FBTA05 (Lymphomun) были проведены аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток и терапия ритуксимабом. FBTA05 (Lymphomun) вводился у 1 пациента в монорежиме - достигнут полный ответ, у 2-го - в комбинации с трансфузией донорских лимфоцитов - стабилизация заболевания, у 3-го - в комбинации с трансфузией донорских лимфоцитов и леналидомидом - частичный ответ. Отработана схема дозирования препарата [64]. Планируется дальнейшее изучение. J.Kochenderfer и соавт. представили результаты применения аутологичных анти-CD19 CART лимфоцитов у 9 взрослых пациентов с рефрактерным течением ДВККЛ (5 пациентов) и ПМВККЛ (4 пациента). Анти-CD19 CART лимфоциты получены за счет специфического взаимодействия мононуклеаров периферической крови с g-ретровирусным вектором, анти-CD3 моноклональным антителом и интерлейкином-2. Перед введением CART лимфоцитов проводилась химиотерапия циклофосфамид/флударабин. Полный ответ достигнут у 2 пациентов с ДВККЛ и 2 пациентов с ПМВККЛ [65]. Y.Wang и соавт. показали возможность применения аутологичных анти-CD20 CART лимфоцитов у 7 взрослых пациентов с рефрактерным течением ДВККЛ. Перед введением CART лимфоцитов проводилась химиотерапия COED (циклофосфамид/винкристин/этопозид/дексаметазон), CHODE (циклофосфамид/доксорубицин/винкристин/этопозид/дексаметазон). Полный ответ достигнут у 1 пациента, частичный ответ - у 4 [66]. На ASPHO 2015 (American Society of pediatric hematology/oncology) S.Maude и соавт. представили результаты применения анти-CD19 CART лимфоцитов у детей с рецидивом и рефрактерным течением В-клеточного острого лимфобластного лейкоза [67]. Исследование возможности применения CART лимфоцитов у детей с ДВККЛ не проводилось. Таким образом, пересмотр существующих критериев стратификации групп риска у больных с ДВККЛ с учетом морфоиммунологических характеристик опухоли, применение новых направлений таргетной терапии позволят уменьшить интенсивность программного лечения у части пациентов.

About the authors

A S Levashov

Pediatric Oncology and Hematology Research Institute of N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: andreyslevashov@mail.ru
115478, Russian Federation, Moscow, Kashirskoe sh., d. 2

A M Kovrigina

National Research Center for Hematology of the Ministry of Health of the Russian Federation

125167, Russian Federation, Moscow, Novyi Zykovskii pr., d. 4

T T Valiev

Pediatric Oncology and Hematology Research Institute of N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

115478, Russian Federation, Moscow, Kashirskoe sh., d. 2

E S Belyaeva

Pediatric Oncology and Hematology Research Institute of N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

115478, Russian Federation, Moscow, Kashirskoe sh., d. 2

A V Popa

Pediatric Oncology and Hematology Research Institute of N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

115478, Russian Federation, Moscow, Kashirskoe sh., d. 2

G L Mentkevich

Pediatric Oncology and Hematology Research Institute of N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Ministry of Health of the Russian Federation

115478, Russian Federation, Moscow, Kashirskoe sh., d. 2

References

Supplementary files