Sravnitel'noe issledovanie opredeleniya HER2-statusa raka molochnoy zhelezy metodami immunogistokhimii i in situ gibridizatsii

Full Text

У спехи в лечении онкологических заболеваний во многом связаны с появлением помимо химиотера- пии препаратов направленного (таргетного) действия. Одним из них является препарат трастузумаб (Герцеп- тин, «Хоффманн-Ля Рош Лтд.», Базель, Швейцария), широ- ко применяющийся при лечении рака молочной железы (РМЖ) и изучаемый для лечения рака других локализаций [1, 2]. Высокая эффективность Герцептина связана с меха- низмами его действия – цитотоксичностью, блокирова- нием пролиферации, стимулированием апоптоза, антиан- гиогенной активностью [3]. Трастузумаб представляет со- бой рекомбинантное гуманизированное моноклональное Рис. 1. Инвазивный протоковый РМЖ. ИГХ-реакция с кон- центрированными антителами к c-erbB2. Оценка – 3+. Ув. 400. Рис. 2. Инвазивный протоковый РМЖ. ИГХ-реакция с анти- телами к HER2/neu. Оценка – 2+. Ув. 400. антитело, связывающееся с рецепторами HER2/neu на по- верхности опухолевых клеток [1]. Онкоген HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2 [4], рецептор 2-го типа человеческого эпидермального фактора роста; синони- мы: HER2/neu [5], Erb B2 [5, 6] и p 185HER2 [7]) расположен в хромосоме 17 (17q21) и кодирует белок – трансмемб- ранную тирозинкиназу размером 185 кДа. Данный белок обладает 44% гомологией с рецептором эпидермального фактора роста (ЭФР) [4, 8]. HER2/neu относится к семейст- ву тирозинкиназных рецепторов ERBB, которое состоит из четырех функционально взаимосвязанных рецептор- ных молекул, играющих важную роль в пролиферации, апоптозе и дифференцировке клеток. Это семейство включает в себя эпидермальный фактор роста (EGF или ERBB1), ERBB2 (HER2/neu), ERBB3, ERBB4 [6, 9, 10]. HER2/neu образует гетеро- и гомодимеры с рецепторами этого семейства и оказывает прямое влияние на работу ря- да сигнальных каскадов, таких как MAPK и PI3K [11, 12]. При гиперэкспрессии белка и/или амплификации гена его влияние может резко усиливаться. Гиперэкспрессия HER2/neu обнаружена в 20–30% инвазивного протоково- го РМЖ, а в случаях неинвазивного рака эта величина до- ходит до 90% [10, 13]. Знание состояния гена HER2/neu и уровня экспрессии белка HER2/neu имеет важное значе- ние для определения прогноза у больных инвазивным РМЖ и для отбора пациентов с наличием гиперэкспрес- сии HER2/neu и/или амплификации гена HER2/neu для ле- чения трастузумабом, так как только в этих условиях пока- зана эффективность препарата [3, 5, 9, 14]. Поэтому все большее значение приобретают точные, прямые и стан- дартные методы определения наличия гиперэкспрессии и/или амплификации HER2/neu. В настоящее время существует несколько методов выяв- ления гиперэкспрессии HER2/neu и/или амплификации гена HER2/neu: иммуногистохимический (ИГХ), гибриди- зация in situ (флюоресцентная и хромогенная), полиме- разная цепная реакция, но на практике доминирующее положение принадлежит ИГХ-методу определения HER2- статуса РМЖ [7, 8]. Исследование проводится на гистоло- гических срезах материала опухоли, залитого в парафин, с использованием нескольких видов поли- и моноклональ- ных антител различных фирм-производителей (Dako, Novocastra, Ventana), обладающих различной чувствитель- ностью, и нескольких типов систем визуализации. В то же время существует готовый к употреблению стандартный набор для фармакодиагностики HER2/neu – «HercepTest» (Dako). При неопределенном ИГХ HER2-статусе (2+) тре- буется проведение исследования, прямо выявляющего на- личие или отсутствие амплификации [15]. Такими метода- ми являются флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) и хромогенная in situ гибридизация гена (CISH) [7, 8, 16, 17]. Оба метода выполняют на срезах с того же образца (блока), на котором проводили ИГХ-исследование. При FISH-гибридизации оценку наличия амплификации гена HER2 проводят путем подсчета соотношения красных флюоресцентных (соответствующих помеченному гену HER2) и зеленых флюоресцентных сигналов, которыми помечен центромерный участок 17-й хромосомы. Соот- 6 | современная онкология №2 | том 11 | 2009 клиническая онкология Таблица 1. Конкордантность (75%) результатов ИГХ-исследования при использовании антител к c-erbB2 и набора «HercepTest» Количество наблюдений c-erbB-2 (баллы)/количество наблюдений HercepTest (баллы)/количество наблюдений Амплификация (FISH)/количество наблюдений 20 0/1+/20 0/1+/20 Нет/20 40 2+/40 0/2 Нет/0 1+/8 Нет/8 2+/26 Нет/16 Есть/10 3+/4 Есть/4 20 3+/20 1+/1 Нет/1 2+/5 Нет/4 Есть/1 3+/14 Нет/1 Есть/13 ношение больше 2 свидетельствует о наличии амплифи- кации HER2. Метод FISH является более чувствительным, Таблица 2. Конкордантность методов FISH и СISH в инвазивном протоковом РМЖ так как позволяет напрямую оценивать наличие (или от- № образца СISH FISH 1–4 ≥10 9,8; 9,6; 8,9; 6,5 5–6 ≥10 3,8; 3,1 7–10 5–10 6,3; 5,8; 5,4; 4,6 11–12 5–10 1,9; 0,3 13–18 ≤5 1,6; 1,5; 1,4; 1,1; 0,7; 0,4 19–20 ≤5 4,3; 2,9 21–22 1–2 3,6; 2,5 23–40 1–2 1,1–1,9 сутствие) амплификации, но и гораздо более дорогостоя- щим, чем ИГХ, так как для его проведения требуется спе- циализированное оборудование и наборы реагентов, вы- пускающиеся фирмами «Dako» и «Vysis». Кроме того, в про- цессе предварительной обработки материала согласно стандартному протоколу сильно нарушается морфология клеток, что затрудняет определение гистологического ва- рианта рака, в частности дифференциальную диагности- ку карциномы in situ и инвазивного рака, что является принципиальным, так как герцепт-статус опухоли оцени- вается только в инвазивном компоненте. Также определенную трудность составляет невозможность хранения срезов с проведенной на них FISH как при комнатной тем- пературе, так и при -18°С, из-за того что флюоресцентный сигнал очень быстро разрушается. Относительно новой и более дешевой альтернативой FISH является метод CISH, основанный на пероксидазном хромогенном окрашивании. Этот метод позволяет выяв- лять амплификацию гена HER2 под световым микроско- пом и учитывать морфологическую картину ткани. Кроме того, срезы с проведенной на них CISH могут длительное время храниться в обычных условиях при комнатной тем- пературе. Однако методика CISH имеет и некоторые недо- статки. Во-первых, она является довольно новым методом и поэтому мало известна в большинстве лабораторий, а во-вторых, как и ИГХ, имеет свою «мертвую зону» при оценке результатов исследований. При использовании CISH (набор фирмы «Zymed») используется один зонд к ге- ну HER2 и проводится подсчет сигналов, пометивших только копии амплифицированного гена. При количестве сигналов более 6 результат оценивается как положитель- ный. В пограничных случаях (3–5 сигналов) возникает не- обходимость дополнительного проведения FISH, который позволяет определить количество хромосом, что влияет на результат в случаях анеуплоидии и полисомии опухоле- вых клеток. Целью нашего исследования было изучение конкор- дантности определения гиперэкспрессии HER2/neu ИГХ- методом при использовании концентрированных анти- тел к c-erbB2 (А0485, Dako) и набора «HercepTest» (Dako) и конкордантности наличия/отсутствия амплификации при ее определении методами флюоресцентной и хромо- генной in situ гибридизации. Материалы и методы Материалом для исследования послужили 80 образцов операционного материала инвазивного протокового РМЖ пациенток, проходивших лечение в МНИОИ им. П.А.Герцена. Ткань фиксировали 10% нейтральным фор- малином в течение 24 ч, проводили по стандартной мето- дике с помощью проводящего аппарата STP 120 («Zeiss»), заливали в парафин, изготавливали срезы толщиной 4 мкм, которые монтировали на высокоадгезивные стекла. Демаскировку антигена согласно инструкции к набору «HercepTest» проводили в водяной бане при температуре 95–98°С в течение 40 мин в цитратном буфере рН 6,0, вхо- дящем в состав набора. Все последующие манипуляции выполняли строго по инструкции к набору. При использо- вании концентрированных антител к c-erbB2 (А0485, Рис. 3. Инвазивный протоковый РМЖ. Флюоресцентная гибридизация in situ. Амплификация гена HER2/neu. Ув. 1000. Dako) использовали разведение 1:400 и коммерческий ци- тратный буфер рН 6,0 (Dako) для демаскировки, которую осуществляли в тех же условиях, что и при использовании набора «HercepTest». Оценку реакции проводили по общепринятой балль- ной системе, разработанной фирмой-производителем на- бора и одобренной к использованию FDA [7, 14]: 0 – полное отсутствие продукта реакции или при выяв- лении на мембранах менее чем 10% клеток инвазивного рака; 1+ – окрашивание слабой интенсивности мембран бо- лее чем 10% клеток инвазивного рака; 2+ – окрашивание умеренной интенсивности мембран более чем 10% клеток инвазивного рака; 3+ – окрашивание яркой интенсивности всей мембра- ны клетки большинства клеток инвазивного рака. Оценку реакции проводили с использованием светово- го микроскопа при 10-кратном увеличении объектива, учитывали только мембранное окрашивание инвазивного компонента опухоли. При оценке реакции 0/1+ герцепт-статус считается от- рицательным и лечение Герцептином не применяется, при реакции 3+ герцепт-статус положительный и может назначаться лечение Герцептином; при реакции 2+ ре- зультат считается неопределенным и проводится FISH-ис- следование для выявления амплификации гена. При налисовременная онкология №2 | том 11 | 2009 | 7 клиническая онкология Рис. 4. Инвазивный протоковый РМЖ. Хромогенная гибри- дизация in situ. Высокая амплификация гена HER2/neu (бо- лее 10 меток). Ув. 1000. Рис. 5. Инвазивный протоковый РМЖ. Хромогенная гибри- дизация in situ. Слабая амплификация гена HER2/neu (3–5 меток). Ув. 1000. Рис. 6. Инвазивный протоковый РМЖ. Хромогенная гибри- дизация in situ. Амплификация гена HER2/neu отсутствует. Ув. 1000. чии амплификации герцепт-статус также считается поло- жительным. Исследование методом FISH проводили по стандартной методике к используемому набору HER2 FISH pharm DxTM Kit (Dako). Для денатурации при температуре 82°С в тече- нии 5 мин и гибридизации (45°С, 20 ч) применяли автома- тический гибридайзер (Dako). Амплификацию оценивали с помощью флюоресцентного микроскопа при увеличении объектива 100. Оценку наличия/отсутствия амплифи- кации проводили путем подсчета соотношения красных и зеленых меток (соответствующих помеченным участкам гена HER2 и центромерного участка) в 20 ядрах. При соот- ношении красных к зеленым меткам 2 и более результат считали положительным. Исследование методом CISH проводили с использова- нием коммерческого набора SPoT-LightR HER2 CISH™ (Zymed). Денатурацию и гибридизацию также проводили в автоматическом гибридайзере. Денатурацию проводили при температуре 95°С 5 мин, гибридизацию – при 37°С в течение ночи. Для визуализации метки проводили имму- нодетекцию. В качестве хромогена применяли ДАБ. Результат гибридизации оценивали с помощью светового микроскопа при увеличении объектива 40. Оценку нали- чия/отсутствия амплификации проводили путем подсчета количества меток в опухолевых клетках. Считали, что амп- лификация гена HER2 отсутствует, если в ядрах более 50% опухолевых клеток наблюдается от 1 до 5 сигналов, слабой если в ядрах более 50% опухолевых клеток находится от 5 до 10 сигналов, сильной – если в большинстве ядер опу- холевых клеток наблюдается более 10 сигналов или круп- ные кластеры гена HER2. Результаты, полученные после проведения FISH, сравнивали с результатами, полученны- ми после проведения CISH, на одних и тех же срезах об- разцов и оценивали конкордантность результатов. Результаты Сравнение концентрированных антител к c-erbB2 и набора «HercepTest» При использовании концентрированных антител к cerbB2 отрицательный герцепт-статус (0/1+) был обнару- жен в 20 случаях инвазивного протокового РМЖ, что пол- ностью совпало с результатами, полученными при ис- пользовании набора «HercepTest» (Dako). FISH-исследова- ние также во всех этих случаях выявило отсутствие ампли- фикации гена (табл. 1). B 40 образцах при использовании концентрированных антител к c-erbB2 был получен результат, оцененный как 2+ и требующий проведения FISH-исследования. Но при использовании набора «HercepTest» было получено расхо- ждение результатов: лишь в 26 образцах оценка реакции совпала. В 4 случаях был найден положительный герцепт- статус 3+, в 8 случаях – реакция была слабой интенсивно- сти – 1+ и в 2 случаях реакция полностью отсутствовала – 0. При FISH-исследовании во всех образцах 3+ обнаруже- на амплификация гена, в случаях 0/1+ амплификация от- сутствовала, а в группе 2+ амплификация была обнаруже- на в 10 образцах из 26, в 16 отсутствовала (см. табл. 1). В группе из 20 образцов, оцененных по ИГХ-исследова- нию с антителами к c-erbB2 как случаи с положительным герцепт-статусом 3+ (рис. 1), при использовании набора «HercepTest» в 14 случаях подтверждена оценка 3+, в 5 об- разцах получена интенсивность реакции 2+, а в одном об- разце герцепт-статус признан отрицательным – реакция 1+ (см. табл. 1). FISH показала наличие амплификации в 13 наблюдениях из 14, имеющих ИГХ-оценку 3+ и в 1 образ- це из 5, имеющих оценку 2+. В остальных случаях ампли- фикация не обнаружена (см. табл. 1). В результате проведенного исследования с использова- нием концентрированных антител к c-erbB2 и набора «HercepTest» получено совпадение герцепт-статуса в 60 образцах из 80, т.е. конкордантность результатов, полу- ченных этими методами, совпала в 75% и расхождение со- ставляет 25%. Анализ этих данных показывает полное сов- падение результатов обоих методов и результатов FISH в группе опухолей с отрицательным герцепт-статусом (0/1+), т.е. использование менее дорогостоящих концент- рированных антител к c-erbB2 полностью позволяет вы- делять пациентов, которым не требуется лечение Герцептином. Но при этом в группе 2+ (по реакции с c- erbB2) концентрированные антитела увеличивают группу образцов, в которых необходимо проводить FISH, в то вре- мя как по результатам реакции с набором «HercepTest» из 40 опухолей это дорогостоящее исследование показано только 26 образцам: 4 опухоли оказались – 3+, что под- тверждается наличием амплификации, и 10 (25% случаев 8 | современная онкология №2 | том 11 | 2009 клиническая онкология из группы 2+) – 0/1+. В группе 3+ (по реакции с c-erbB2) «HercepTest» подтверждает оценку реакции в 14 опухолях из 20 (рис. 2). Исследование амплификации показывает ее наличие в 13 образцах (рис. 3). Наши данные сравнимы с результатами других авторов: по данным литературы, дискордантность c-erbB2 и набо- ра «HercepTest» составляет 15–25% [16, 18, 19]. В группах опухолей 3+ и 0/1+ (по данным «HercepTest») нами получе- но совпадение с результатами FISH-реакции в 95% наблю- дений. В группе опухолей 2+ амплификация гена была об- наружена в 11 из 31 случая (2+ по данным «HercepTest»), т.е. примерно в 30%, что сходно с результатами, полученными рядом зарубежных авторов [9, 15]. Сравнение методов FISH и CISH В группе с HER2-статусом 2+ на 40 образцах инвазивного протокового РМЖ амплификация также исследована методами FISH и CISH. По результатам СISH, наличие амп- лификации гена HER2 выявлено у 12 (30%) больных [силь- ная амплификация – у 6 (15%) пациентов – рис. 4, слабая амплификация – также у 6 (15%) пациентов – рис. 5], и у 28 (70%) больных амплификации гена HER2 не выявлено – рис. 6. Конкордантность методов FISH и СISH при инвазивном протоковом РМЖ составила 85% (табл. 2). К настоящему моменту метод FISH признан в качестве «золотого стандарта» для определения HER2-статуса, а не- давно разработанный и внедряемый метод СISH также ста- новится все более популярным [16, 20]. Оба метода разра- ботаны на основе прямой гибридизации меченого зонда с ДНК-мишенью, и, соответственно, и FISH, и СISH имеют высокую чувствительность, что крайне важно для назначе- ния Герцептина. Кроме того, у СISH есть и другие преиму- щества: простота использования и стоимость, так как для оценки результатов используется стандартный световой микроскоп, препараты переносят длительное хранение при комнатной температуре и могут в дальнейшем ис- пользоваться для пересмотра или уточнения диагноза. Од- нако кроме очевидных преимуществ, СISH также имеет недостатки, и некоторые из них могут являться сущест- венными при использовании этого метода для массовой диагностики. Хромогенная гибридизация основана на мо- нохромном окрашивании гибридизованного участка гена HER2, и при оценке результата подсчитывается только ко- личество таких участков, но при этом не выявляется и не учитывается число центромерных участков 17-й хромо- сомы, где эти участки располагаются. Таким образом, слу- чаи анеуплоидии и полиплоидии (полисомии) могут явля- ться ложноположительным результатом, что может отра- жаться на эффективности применения Герцептина. В та- ких случаях FISH как референсный метод дает возмож- ность дифференцировать полиплоидные клетки от кле- ток с истинной амплификацией HER2. Поэтому конкор- дантность методов FISH и СISH не является полной. В на- шей работе она составила 85%, что согласуется с результа- тами, полученными другими исследователями – от 84 до 100% [9, 15, 17]. Совпадение результатов в 100% показано только J.Zhao и соавт. [20], однако они применяли одно- цветную разновидность FISH, при которой так же, как и в случае с СISH, окрашивался только амплифицированный участок гена HER2. Заключение Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что использование концентрированных анти- тел к c-erbB2 экономически оправдано лишь для выявления группы отрицательного герцепт-статуса РМЖ на больших когортах пациентов. Для выявления пациентов, подлежащих лечению Герцептином (при получении ре- зультата HER2-статуса опухоли 2+ или 3+), необходимо подтверждение полученных результатов с помощью набо- ра «HercepTest», а при повторении оценки 2+ обязательно требуется тестирование с помощью FISH-метода. Конкордантность методов FISH с использованием двух- цветных зондов (на участки центромеры 17-й хромосомы и гена HER2) и СISH с использованием монохромного зонда, комплементарного только участку HER2, составляет 85%. Следовательно, для окончательной диагностики на- личия амплификации гена HER2 целесообразно исполь- зовать метод FISH, так как получаемые с его помощью ре- зультаты более точно отражают истинный HER2-статус пациентки, что крайне важно для назначения таргетной терапии. Метод CISH позволяет с высокой вероятностью выделять группу опухолей с высокой амплификацией и может использоваться в отделениях патологической ана- томии, не имеющих оборудования для флюоресцентного исследования. Образцы опухолей с низкой амплификаци- ей гена должны обязательно повторно исследоваться с по- мощью метода FISH. Данное исследование поддержано Представительством фармацевтической компании «Hoffmann-La Roche» в Рос- сии. Реферат Изучена конкордантность результатов иммуногистохи- мического исследования, выполненного с использовани- ем концентрированных антител к c-erbB2 и набора «Her- cepTest». Исследование проведено на 80 образцах инва- зивного протокового рака молочной железы с помощью иммуногистохимического метода и гибридизации in situ. Конкордантность изученных методов составила 75%. Использование антител к c-erbB2 предлагается для прове- дения первичного скрининга рака молочной железы, а на- бор «HerceрTest» рационально применять для контроля группы с положительным герцепт-статусом.

About the authors

L E Zavalishina

Yu Yu Andreeva

A A Ryazantseva

M V Bateva

G A Frank

References

Supplementary files