Molekulyarno-biologicheskie faktory prognoza pri B-kletochnom khronicheskom limfoleykoze

Full Text

В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) является самым частым лейкозом у взрослых. Согласно статистическим расчетам в 2006 г. В-ХЛЛ заболеют около 4500 россиян и 2300 погибнут от этой болезни. В последние годы тактика ведения В-ХЛЛ претерпевает значительные изменения. Это связано с появлением новых препаратов, вызывающих полные ремиссии, разработкой высокочувствительных молекулярных и иммунофенотипических способов слежения за минимальной остаточной болезнью, внедрением в клиническую практику новых методов анализа молекулярных признаков этой болезни. Соответственно меняются цель и показания к началу терапии хронического лимфолейкоза. У многих пациентов необходимо добиваться полной ремиссии. На смену традиционной тактике, в соответствии с которой течение В-ХЛЛ подразделялось на начальную стадию, не требующую терапии, и стадию развернутых клинических проявлений, когда терапия показана, приходит адаптированная к риску терапия. При этом подходе в дебюте болезни определяются факторы прогноза В-ХЛЛ. Они позволяют установить, каким пациентам следует начинать лечение вскоре после установления диагноза и какой вариант лечения предпочтителен. На практике адаптированную к риску терапию В-ХЛЛ можно применять, используя генетические или статичные факторы прогноза. Классические или динамичные маркеры прогноза, такие как тип инфильтрации костного мозга, уровень лейкоцитов, уровень растворимого в сыворотке CD23, коррелируют с массой опухоли и меняются со временем. Напротив, генетические маркеры прогноза - цитогенетические аберрации и мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов - не меняются со временем и уже в дебюте предсказывают неблагоприятное течение В-ХЛЛ. В данной работе мы сосредоточимся на прогностической и патогенетической информации, которую позволяет получить молекулярный анализ генов иммуноглобулинов в клетках В-ХЛЛ. В 90-х годах В-ХЛЛ был подразделен на 2 варианта в зависимости от наличия или отсутствия признаков соматической гипермутации в генах вариабельного региона иммуноглобулинов (IgVH) (Fais и соавт., 1998). Известно, что в ходе ответа на антиген В-клетки проходят стадию соматической гипермутации, во время которой на небольшом по протяженности участке (1500-2000 нуклеотидов), соответствующем перестроенному V-(D)-J-сегменту, возникает множество мутаций. Мутации возникают случайным образом, часть из них приводит к аминокислотным заменам и меняет белковую последовательность вариабельного региона антитела. Мутационному процессу сопутствует селекция антигенами, концентрируемыми на поверхности фолликулярных дендритических клеток в фолликулярных центрах. До соматической гипермутации VH-гены обычно кодируют низкоаффинные антитела полиреактивной специфичности. Высокая аффинность антител и необыкновенное разнообразие специфичности достигаются в значительной степени за счет соматической гипермутации. Клетки, в которых гены иммуноглобулинов содержат мутации, считаются клетками памяти, поскольку они контактировали с антигеном. Если мутаций в генах вариабельного региона нет, речь идет либо о наивных В-клетках, либо о В-клетках, развивавшихся по альтернативному пути и миновавших стадию соматической гипермутации. Факт прошедшей соматической гипермутации можно оценить. Для этого определяют нуклеотидную последовательность, соответствующую вариабельному региону генов иммуноглобулинов и сравнивают ее с последовательностями герминальных V-генов, опубликованных в общедоступных базах данных. Если полученная последовательность VH-гена на 100% совпадает (гомологична) с герминальной, клетка-предшественница этого варианта В-ХЛЛ не проходила этап соматической гипермутации. В случае прошедшей гипермутации на участке протяженностью 300 п.н. обычно выявляется не менее 5 мутаций, что позволяет утвеждать, что данная клетка проходила стадию герминального центра. Признаки соматической гипермутации выявляются в клетках большинства лимфом, поскольку они возникают из клеток центра фолликула и постфолликулярного уровня. Отсуствие мутаций вариабельного региона характерно для острых лимфобластных лейкозов и большинства случаев лимфомы из клеток мантийной зоны. Хронический В-клеточный лимфолейкоз гетерогенен по мутационному статусу генов иммуноглобулинов. Было показано, что варианты В-ХЛЛ с разным мутационным статусом радикально различаются по прогнозу (Damle, 1999; Hamblin, 1999). Прогностическое значение мутационного статуса подтверждено многими группами. В этой работе мы обобщаем данные, полученные в нашей лаборатории в последние годы, и проводим сравнение с данными, полученными другими исследователями. В настоящее время анализу доступно 177 пациентов. Средний возраст больных 53 года (22-83), 65% мужчин. Традиционной границей гомологии герминальному VH-гену, позволяющей различать прогностически разные варианты, считается 98%. При границе в 98% гомологии 106 пациентов (60%) имеют вариант без мутаций вариабельного региона (U-CLL) и 71 (40%) - вариант с мутациями (M-CLL). Эти данные практически точно совпадают с результатами, полученными в двух других крупных исследованиях, проведенных в Европе. В нескольких более ранних работах пропорции больных U-CLL и M-CLL были распределены примерно одинаково. Преобладание больных с U-CLL некоторые авторы связывали с селекцией: мутационный статус определяется в крупных центрах, куда стекаются пациенты с более агрессивным течением В-ХЛЛ. Тем не менее по мере увеличения числа пациентов в исследованиях стало ясно, что это не так: 60% больных имеют более агрессивный вариант и 40% менее агрессивный. Сходство этих данных дает возможность сравнить наше исследование с другими. В последние годы большое внимание было уделено четырем темам: 1) рубежному значению степени гомологии герминальному VH-гену, позволяющему наиболее точно выделять прогностические группы; 2) комбинированию стадий и мутационного статуса, что позволило бы выделять более однородные прогностические группы больных; 3) поиску суррогатных маркеров мутационного статуса, упрощающих оценку прогноза; 4) прогностическому значению подгрупп пациентов В-ХЛЛ с использованием отдельных VH-генов. В двух работах авторы исследовали прогностическое значение разной степени гомологии герминальным VH-генам. Степень гомологии 98% взята с учетом возможного аллельного полиморфизма VH-генов. В идеале, если клетка не проходила стадию соматической гипермутации, последовательность VH-гена не должна содержать мутаций вообще и на 100% совпадать с герминальной последовательностью (т. е. последовательностью такого же VH-гена в нелимфоидных клетках, где гены иммуноглобулинов не изменяются вообще). Поскольку при констатации гомологии мы ориентируемся на последовательности, опубликованные в базах данных, и не знаем, какова в точности последовательность данного VH-гена у данного субъекта, допустима гомология в 98%. Это означает, что последовательность VH-гена может отличаться от герминальной на 4 нуклеотида. Известный к настоящему времени аллельный полиморфизм VH-генов очень низок. Поэтому отличие на большее число нуклеотидов вряд ли является случайным. Тем не менее было показано, что уровень 97% обладает максимальной дискриминирующей силой (Krober, 2002; Tobin, 2004). В нашей выборке существенных различий при рубежном значении гомологии 97 и 98% не было. Уровень в 97% гомологии герминальному VH-гену имели 13 пациентов из 177 (7%). Из них у 3 больных был «тлеющий вариант» В-ХЛЛ со сроком наблюдения 17 и 21 год. Двое больных умерли в течение 3 лет от момента установления диагноза и это было связано, скорее всего, с трансформацией. У остальных пациентов клиническое течение В-ХЛЛ ближе к благоприятному, хотя срок наблюдения невелик. В нашей выборке максимальное дискриминирующее различие имел уровень в 98%. Возможно, что это связано с неодинаковой частотой использования VH-генов в российской и европейских популяциях. Комбинирование мутационного статуса со стадиями Очень важно, что прогностическое значение мутаций вариабельного региона сохраняется в пределах стадий, т. е. мутационный статус является независимым прогностическим маркером. В нашей выборке достоверные различия сохранялись у больных со стадиями 0 + I, 0 + I + II. Достоверных различий в выживаемости у больных с анемией и тромбоцитопенией (стадии III + IV) нет, хотя число больных невелико. Tobin и соавт. показали, что у больных с прогностически благоприятным вариантом В-ХЛЛ с мутациями вариабельного региона большое прогностическое значение имеет подразделение на стадии (А против B + C). Эти авторы предложили подразделять больных В-ХЛЛ на 3 группы: 1) без мутаций вариабельного региона; 2) с мутациями вариабельного региона в стадии A; 3) с мутациями вариабельного региона и стадиями B/C. Мы также получили такую закономерность. Однако, в нашей выборке у больных без мутаций вариабельного региона распределение больных на стадии также имеет значение. Нам представляется самым важным преимуществом мутационного статуса возможность предсказать неблагоприятное течение В-ХЛЛ уже в самом дебюте заболевания. Сохранение прогностического значения стадий в пределах вариантов В-ХЛЛ с разным мутационным статусом еще раз подчеркивает неоднородность этих вариантов В-ХЛЛ. Однако комбинирование мутационного статуса со стадиями, на наш взгляд, не имеет большого преимущества. Прогноз В-ХЛЛ должен опираться на геномные маркеры, которые не меняются со временем. В частности, доказано, что флударабин не эффективен в случаях В-ХЛЛ с делецией 17p. Поэтому выявление больных с делецией 17p имеет принципиальное значение, поскольку требует другого лечения. Суррогатные маркеры мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов Третья тема, получившая развитие в последние годы, связана с поиском суррогатных маркеров мутационного статуса. Определение мутационного статуса генов вариабельного региона - трудоемкая методика, которая малоприменима в практической медицине. В связи с этим очень важно выявить другие маркеры, достоверно коррелирующие с мутационным статусом. В конце 90-х годов была установлена корреляция мутационного статуса с экспрессией CD38. Практически у всех пациентов с вариантом M-CLL экспрессия CD38 низкая. Напротив, у больных без мутаций вариабельного региона экспрессия CD38 вариабельна. В нашей выборке данные по экспрессии CD38 были доступны у 75 больных без мутаций вариабельного региона. Из них у 20 CD38 экспрессировался менее чем на 30% опухолевых клеток. Таким образом, несовпадение мутационного статуса и экспрессии CD38 наблюдается у 26% больных, что не позволяет использовать CD38 как суррогатный маркер. Тем не менее сама по себе экспрессия CD38 имеет достоверное прогностическое значение. Другие маркеры были обнаружены в экспериментах с микрочипами. Глобальная оценка экспрессионного профиля В-ХЛЛ была проведена в трех крупных исследованиях (Klein, 2001; Rosenwald, 2001; Haslinger, 2004). В двух исследованиях микрочипы использовались для сравнения В-ХЛЛ с разными субпопуляциями нормальных лимфоцитов и для выявления генетических различий в пределах В-ХЛЛ. Klein и соавт. заключили, что В-ХЛЛ ближе всего к В-клеткам памяти, чем к другим субпопуляциям. Rosenwald и соавт. сравнили варианты В-ХЛЛ с различным мутационным статусом и заключили, что вариант В-ХЛЛ без мутаций близок к активированным В-клеткам, а не к клеткам покоя. Общий экспрессионный профиль В-ХЛЛ, по данным Rosenwald, также в большей степени соответствует клеткам памяти. В исследовании Haslinger проведена оценка профиля экспрессии генов с геномными аберрациями и мутационным статусом. Во всех трех исследованиях было идентифицировано несколько сверхэкспрессированных и слабо экспрессирующихся генов при разных вариантах В-ХЛЛ. Интересно, что списки генов, полученные в разных исследованиях, пересекаются лишь отчасти. Одним из важных генов, дискриминирующих варианты В-ХЛЛ с разным мутационным статусом, оказался ген, кодирующий ZAP-70. Протеинкиназа ZAP-70 передает сигналы, поступающие с Т-клеточного рецептора. Оказалось, что этот ген экспрессируется при варианте В-ХЛЛ без мутаций вариабельного региона и не экспрессируется при варианте с мутациями. Эта находка сразу получила дальнейшее развитие и легла в основу диагностического теста, выполняемого с помощью проточной цитофлюориметрии или иммуногистохимии. Тем не менее многие лаборатории столкнулись с проблемой в установлении рубежного значения экспрессии ZAP-70. Процент несовпадения экспрессии ZAP-70 с мутационным статусом колеблется в разных работах от 5 до 23%. Нами проведен анализ результатов, полученных в трех крупных исследованиях В-ХЛЛ с помощью микрочипов. При сопоставлении данных из нескольких сотен генов мы выбрали 4, различия по которым наиболее велики и подтверждены во всех трех исследованиях. Это гены LPL (Lipoprotein lipase), DMD (Dystrophin), ZNF288 (Zinc finger protein 288) и ZAP-70 (Zeta-chain associated kinase 70 kDa). Для оценки экспрессии этих генов нами разработана система ПЦР в реальном времени. В это исследование включено 105 больных. Из них у 65 оценка экспрессии проведена в цельной фракции мононуклеаров периферической крови, а у 40 больных после предварительной селекции CD19+В-лимфоцитов. Мы смогли подтвердить корреляцию с мутационным статусом экспрессии трех генов DMD, ZAP-70 и LPL. Число больных с относительно высокой и относительно низкой экспрессией ZNF288 было одинаково распределено в группах с разным мутационным статусом. Корреляция экспрессии ZAP-70 была более достоверной, если предварительно проводилась селекция CD19+клеток. Это может объясняться тем, что экспрессия ZAP-70 высока в Т-лимфоцитах. Абсолютное число Т-лимфоцитов при В-ХЛЛ всегда повышено. Наиболее важным геном, по которому были получены выраженные различия, оказался ген, кодирующий липопротеинлипазу. Экспрессия липопротеинлипазы достоверно коррелировала с мутационным статусом вне зависимости от того, выполнялась ли предварительно селекция CD19+ клеток или нет. Для того чтобы понять, какие популяции клеток крови могут экспрессировать липопротеинлипазу в норме, мы изучили ее экспрессию в CD19+-, CD4+- и CD8+-лимфоцитах здоровых доноров. Оказалось, что этот фермент экспрессируется только цитотоксическими CD8+-клетками. В нормальных В-лимфоцитах ее экспрессия практически не выявлялась. Липопротеинлипаза выполняет одновременно двоякую функцию, являясь как ферментом, катализирующим гидролиз триглицеридов, так и рецептором, осуществляющим захват липопротеинов. Причины повышенной экспрессии липопротеинлипазы в опухолевых клетках В-ХЛЛ не ясны. Более того, как и в случае с ZAP-70, до экспериментов с микрочипами не было известно, что липопротеинлипаза может экспрессироваться в В-лимфоцитах. Определение экспрессии липопротеинлипазы может стать важным новым маркером прогноза В-ХЛЛ в ближайшие годы. VH-гены как маркеры проноза Совокупность специфичностей всех антител у человека называется «В-клеточный репертуар». Не существует прямого способа узнать специфичность всех антител и их количество у данного субъекта. Это можно сделать косвенно, анализируя частоту использования VH-, D- и JH-генов. В связи с трудоемкостью такого анализа до сих пор в нашем распоряжении имеются ограниченные данные о VH-, D- и JH-репертуаре у здоровых лиц разного возраста. Что касается пожилых, нам известно о двух исследованиях, в которых полный репертуар изучен у трех лиц старше 60 лет. В этих исследованиях перестроенные VH-D-JH-регионы амплифицировали из отдельных клеток, забранных микроманипулятором из мазка крови. Проанализировав VH-D-JH-регионы из нескольких сотен В-лимфоцитов, можно получить представление о репертуаре. В случае лимфатических опухолей мы анализируем репертуар не в отдельных клетках, а в клонах опухолевых В-клеток, носителями которых являются пациенты. Если частота использования VH-, D- и JH-генов в выборке лимфом данного типа совпадает с нормой, то патогенетическое значение антигенной селекции маловероятно. Если же репертуар VH-, D- и JH-генов существенно отличается от нормы, можно предполагать, что клетки-предшественницы данной опухоли подвергались антигенной селекции. Как и многие другие лимфатические опухоли, В-ХЛЛ характеризуется неслучайным репертуаром антител. Шведской группой была выделена группа больных В-ХЛЛ, у которых вариабельный регион кодировался геном VH3-21. При этом структура вариабельного региона (D- и JH-гены) у этих пациентов была практически одинаковой. Кроме того, в большинстве этих случаев использовался один тип легкой цепи, вариабельные регионы которой были также практически идентичны. Такое совпадение структуры антител у разных больных не может быть случайным и, возможно, говорит о существовании единого антигена, имеющего патогенетическое значение в развитии В-ХЛЛ. Более того, оказалось, что вариант В-ХЛЛ с использованием VH3-21 имеет относительно неблагоприятный прогноз независимо от наличия или отсутствия мутаций. Европейскими исследователями проведено сравнение частоты использования VH-генов в разных странах и было показано, что VH3-21 выявляется существенно чаще в северных странах, особенно часто в Швеции (9%), и реже в южных странах (2-3%). По нашим данным, частота использования VH3-21 в российской популяции невысока. Этот ген кодировал вариабельный регион всего у 2 больных из 177 (1,1%). Из представленных данных можно видеть, что выборки различаются и по использованию гена VH1-69. Этот ген используется при В-ХЛЛ чаще всего. Однако в европейском исследовании его частота 14%, тогда как в российской популяции он использовался в 45 случаях из 177 (25%), причем всегда в группе без мутаций вариабельного региона. Мы сравнили выживаемость больных В-ХЛЛ с использованием VH1-69 c остальной выборкой больных без мутаций вариабельного региона. Медиана выживаемости больных в группе VH1-69 составила 94 мес, а у остальных больных без мутаций IgVH - 89 мес. Различия недостоверны. Таким образом, несмотря на возможное патогенетическое значение, VH1-69 не характеризует выборку больных с худшим прогнозом. Анализу специфичности антител, экспрессируемых клетками В-ХЛЛ, посвящено много исследований. Было показано, что они низкоаффинны и по этой причине полиреактивны. Они связываются с ДНК, компонентами мембран, могут иметь активность ревматоидного фактора. Однако антигены, возможно, провоцирующие развитие В-ХЛЛ, не установлены. Таким образом, мутационный статус и его суррогатные маркеры имеют большее значение в прогнозировании течения В-ХЛЛ. В будущем предстоит установить, какие из прогностических маркеров предсказывают ответ на флударабинсодержащие курсы химиотерапии. Недавно опубликованы результаты исследования эффективности курса FCR у первичных пациентов В-ХЛЛ (M. Keating, 2005). Курс FCR вызывает 70% полных ремиссий. Предикторами безуспешности терапии были уровень лейкоцитов более 200 тыс/мкл, увеличение печени, тромбоцитопения и повышение уровня β2-микроглобулина более 4 г/л. Корреляции между экспрессией ZAP-70 и ответом на терапию не было (данные не опубликованы). Возможно, что с появлением новых видов терапии определение мутационного статуса будет иметь меньшее значение. Как свидетельствуют кривые выживаемости многочисленных исследований, различия в прогнозе можно обнаружить при среднем сроке наблюдения за больными около 10 лет. Это означает, что большинство пациентов, включавшихся в эти исследования, не получали флударабин в качестве первой линии терапии. Иными словами, прогностическое значение мутационного статуса доказано для больных «дофлударабиновой» эры. Поэтому на сегодняшний день мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов является маркером долгосрочного прогноза В-ХЛЛ, основная роль которого состоит в идентификации пациентов, которые требуют более раннего начала терапии.

About the authors

E A Nikitin

S G Malakho

B V Biderman

A B Poltaraus

A B Sudarikov

Supplementary files