Биобанк ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России как ресурс для проведения исследований в области персонифицированной медицины

Полный текст

В последние десятилетия ранняя диагностика рака стала одним из основных направлений исследований в онкологии [1]. Секвенирование генома человека в 2001 г. проложило новый путь для изучения рака с улучшенным молекулярным профилированием, геномными и протеомными исследованиями [2]. Данная технология позволила глубже исследовать механизмы рака, от клеточного до субклеточного и молекулярного уровней, дав начало персонифицированной медицине [3]. Крупномасштабные исследования в данной области требуют объемных выборок биоматериала и данных пациентов для статистических анализов и разработок новых гипотез. Однако довольно часто исследовательские группы сталкиваются с проблемой формирования групп пациентов по той или иной нозологии в пределах научных лабораторий, региона или страны. Биобанки, или биорепозитории, в свою очередь, являются надежным решением такой проблемы, так как накопленные там образцы уже содержат клиническую и лабораторную информацию о пациентах, патологиях, типах собранных тканей, проверке качества биообразцов и температурных режимах криоконсервации [4].

На сегодняшний день в мировом сообществе создано множество биорепозиториев, в которых образцы разделяют по расе, популяции, типу, стадии и степени различных видов рака на основе клинических данных пациентов [5]. Помимо относительно небольших биобанков, созданных научными группами, существуют сети очень обширных и известных биобанков, часто финансируемых государством и доступных для исследовательских целей. Так, например, в России существует Национальная ассоциация биобанков и специалистов по биобанкированию (НАСБИО), которая по информации на август 2021 г. насчитывает порядка 27 биобанков, в числе которых – биобанк ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (nasbio.ru). В Европе находится сеть биобанков Biobanking and BioMolecular resources Research Infrastructure – European Research Infrastructure Consortium (BBMRI-ERIC), которая объединяет 325 биобанков из 20 стран Европы, а также EuroBioBank (www.eurobiobank.org), который включает 22 биобанка. В Азии располагается Национальный биобанк Кореи (NBK), который интегрирован с 17 региональными корейскими биобанками. Однако больше всего биобанков находится в США. В 2017 г. сформировано 636 биорепозиториев на территории США [6]. Еще одной ведущей организацией в области биобанкирования в Европе является European Association for Predictive, Preventive & Personalised Medicine (EPMA), которая представлена в 54 странах мира, активно продвигая проекты по персонифицированной медицине в биологических науках и практической медицине [7, 8].

В мае 2018 г. на сайте biobanking.com опубликован топ-лист 10 крупнейших биобанков мира (рис. 1).

 

Рис. 1. Крупнейшие биобанки мира по версии biobanking.com.

Fig. 1. The largest biobanks in the world according to biobanking.com.

 

Биобанк ФГБУ «НМИЦ онкологии» представляет собой отдельную инфраструктуру с большими сложными коллекциями биологических образцов, дополненными обширными и хорошо аннотированными клиническими и патологическими данными о пациентах, включая медицинские изображения, патологическую гистологию и молекулярный анализ [9].

Коллекции образцов криохранилища формировались в зависимости от задач и проектов ФГБУ «НМИЦ онкологии» с постоянным каталогизированием, включая штрихкодирование, ведение баз по клинической информации о пациентах от нескольких отделений и систематизированное заполнение Freezer Pro (база криоштативов). Впоследствии информацию использовали для различных генетических и молекулярных исследований, включающих корреляции генотип-фенотип, перекрестные исследования, исследования «случай-контроль» и когортные исследования. Для обеспечения конфиденциальности и анонимности все образцы коллекций были зашифрованы в соответствии с внутренней кодировкой проектов ФГБУ «НМИЦ онкологии». Также при сборе проб пациент всегда был проинформирован о целях исследования, важности его участия в исследованиях рака, потенциальных рисках и шансах отказа в любой момент в будущем.

Сбор, обработка и хранение биоматериала

Стабильность работы биобанка на сегодняшний день сохраняется благодаря разработанным алгоритмам действий подразделений исследовательских и клинических групп, включающих сбор клинической информации, биологического материала, пробоподготовку, контроль качества биообразцов, хранение, а также соблюдение правовых норм и правил, связанных с конфиденциальностью пациентов (рис. 2).

 

Рис. 2. Схема работы Биобанка.

Fig. 2. The scheme of Biobank processes.

 

Кровь

Чтобы гарантировать как количество (например, выход ДНК), так и качество (например, неповрежденную ДНК) образца, мы учитывали этапы предварительной обработки исходного материала, такие как центрифугирование или добавление стабилизирующих агентов для ингибирования деградации ДНК в образце. Для сбора цельной крови на базе биобанка ФГБУ «НМИЦ онкологии» использовали пробирки с К2ЭДТА. Несмотря на то что гепариновые пробирки широко используются для определения уровней гормонов или холестерина в повседневной клинической практике, они не являются предпочтительными для молекулярных анализов. Раствор К2ЭДТА сохраняет клетки и ингибирует активность ДНКазы; его применение дает более высокие концентрации ДНК, сохраняя качество образцов [10]. Наряду с цельной кровью для молекулярных исследований используют сыворотку или плазму крови для анализов внеклеточной ДНК, белков или гормонов [11]. Транспортировку крови из отделений в криохранилище осуществляли в криоконтейнере с жидким азотом. Все образцы крови в ФГБУ «НМИЦ онкологии» хранятся при температуре от -80°С.

Примерами крупных биобанков с коллекциями образцов крови онкологических больных являются Биобанк Великобритании [12], Биобанк Японии [13], Викторианский био-банк рака [14] и Канадская сеть репозиториев опухолей [15].

Микробиота

Образцы микробиоты используют для исследований иммунного ответа, таргетной терапии, поиска биомаркеров, а также для трансплантации фекальной микробиоты, как было показано в работе Е. Terveer и соавт. [16]. В основном микробиоту генотипируют методом секвенирования нового поколения (NGS), используя в качестве маркера 16S рРНК [17]. Ген 16S рРНК кодирует прокариотическую небольшую 30S субъединицу 70S рибосомного комплекса у большинства бактерий и архей. Последовательность гена состоит из высококонсервативных сайтов связывания праймера и 9 вариабельных областей (V₁–V₉). Большинство протоколов генотипирования на основе 16S рРНК используют V₅–V₆, V₃–V₄ [18].

При отборе образцов важно минимизировать время забора биоматериала и использовать ресурсы асептической лаборатории, поскольку изменения температуры, влажности или других факторов могут загрязнить образцы [19, 20]. Состав микробов нестабилен с момента взятия пробы, поэтому немедленное замораживание считается обязательным [21]. В исследовании фекальной микробиоты человека было показано, что быстрое охлаждение при -80°C и добавление криоконсерванта сохраняют разнообразие микробиоты, которое значительно изменяется при хранении в сухом виде при 4°C [22, 23].

Так, на базе биобанка ФГБУ «НМИЦ онкологии» в рамках проекта «Создание банка биообразцов сыворотки крови и фекалий здоровых доноров и больных раком легкого с различным течением и определение в них содержания кинуренинов, адипокинов и цитокинов» сформирована коллекция из 200 образцов микробиоты, из них 100 – от пациентов с диагнозом рака легкого и 100 – от условно здоровых доноров. Биоматериал хранили при температуре +4°С после забора в течение 24 ч, далее замораживали при -80°С в криоконсерванте (25% раствор глицерина) для долговременного хранения.

Согласно данным в выборках контрольной и основной групп подавляющим большинством были доноры русской национальности. На рис. 3,4 представлено распределение по национальной принадлежности.

 

Рис. 3. Распределение основной группы пациентов по национальной принадлежности, n=100.

Fig. 3. Distribution of the main group of patients by nationality, n=100.

 

Рис. 4. Распределение контрольной группы по национальной принадлежности, n=100.

Fig. 4. Distribution of the control group by nationality, n=100.

 

Гендерно-возрастной состав пациентов и доноров контрольной группы, вошедших в исследование, представлен на рис. 5. Средний возраст пациентов составил 60,48 года с диапазоном вариации от 36 до 81 лет. Средний возраст условно здоровых доноров составил 31,92 года с диапазоном вариации от 23 до 62 лет.

 

Рис. 5. Гендерный состав пациентов и доноров контрольной группы.

Fig. 5. Gender composition of patients and donors of the control group.

 

В основной группе пациентов мужского пола было больше – 68% в отличие от контрольной группы, где число условно здоровых доноров женского пола составило 79%.

Распределение пациентов основной группы по стадии заболевания рака легкого представлено на рис. 6.

 

Рис. 6. Распределение пациентов по стадии заболевания рака легкого.

Fig. 6. Stage distribution for patients with lung cancer.

 

В исследовании преобладали больные с III стадией рака легкого, на их долю приходилось 52% выборки. Доля пациентов на терминальной, IV стадии заболевания составила 18%, а доля пациентов со II стадией заболевания – 19%. В исследованной выборке уровень пациентов на ранней стадии I не превышал 11% (рис. 7).

 

Рис. 7. Распределение пациентов основной группы по TNM классификации заболевания рака легкого.

Fig. 7. Distribution of patients of the main group according to the lung cancer TNM classification.

 

Депонирование образцов свежезамороженных опухолевых тканей

В ходе стандартной операционной процедуры по резекции органа врач-хирург передавал биоматериал на сухом льду в течение 10–20 мин в патологоанатомическое отделение в комплекте с информированным согласием от пациента и выпиской из истории болезни. Далее врач-патологоанатом вырезал 4 равных образца опухолевой ткани и 2 условно здоровой, находящихся на максимальном удалении от опухолевой, размерами не менее 0,5×0,5×0,5 см. Одновременно производился зеркальный забор материала для стандартного гистологического исследования. Образцы ткани в криопробирках помещали в жидкий азот, а затем в криохранилище в пары жидкого азота на долгосрочное хранение при температуре хранения от -150 до -196°C.

Критерии включения материала в исследование: размер ткани не менее 0,5×0,5×0,5 см; доля опухолевых клеток в образце не менее 20%; соблюдение временного интервала заморозки образца в жидком азоте не более 20 мин с момента экстракции образца в операционной.

 

Рис. 8. Распределение образцов свежезамороженных тканей по локализации злокачественного процесса.

Fig. 8. Distribution of fresh frozen tissue samples derived from the malignant process.

 

Гистологически верифицированные парные образцы свежезамороженных биоптатов были депонированы в коллекции биобанка от 1834 пациентов со следующими злокачес- твенными новообразованиями (рис. 8):

• рак желудка – 424 образца (опухоль/норма);
• колоректальный рак – 438 образцов (опухоль/норма);
• рак поджелудочной железы – 195 образцов (опухоль/норма);
• рак пищевода – 380 образцов (опухоль/норма);
• рак молочной железы – 397 образцов (опухоль/норма).

Таким образом, преобладающая часть депозитария состоит из образцов тканей пациентов с диагнозами злокачественных новообразований толстой кишки и желудка.

Коллекции клеточных линий

В биорепозитории ФГБУ «НМИЦ онкологии» содержатся коллекции первичных и иммортализованных клеточных линий. Первичные клеточные линии получали из послеоперационного материала, отобранного в ходе удаления опухолей. Для создания первичных культур использовали методы первичных эксплантатов, ферментативной диссоциации или механической дезагрегации [24, 25].

Все коллекционные клеточные линии свободны от контаминантов (экзогенных вирусов, микоплазм и L-форм бактерий) и культивируются без антибиотиков. В коллекцию входит 24 клеточных линий человеческого происхождения (рис. 9).

 

Рис. 9. Иммортализованные клеточные линии биобанка ФГБУ «НМИЦ онкологии».

Fig. 9. Immortalized cell lines of the biobank of the National Medical Research Centre for Oncology.

 

Заключение

Биобанки – это сложная система хранения биологических образцов и связанных с ними данных, имеющих особое значение для прикладных и фундаментальных исследований. На материале образцов тканей нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы и глиальных опухолей различной степени злокачественности были выполнены исследования по определению прогностических биомаркеров и потенциальных мишеней для таргетной терапии методом высокопроизводительного секвенирования [26, 27].

Таким образом, данные коллекций биобанка играют важную роль для персонифицированной медицины, обеспечивая раннюю диагностику и эффективные методы лечения каждому пациенту.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Авторы декларируют соответствие своего авторства международным критериям ICMJE. Все авторы в равной степени участвовали в подготовке публикации: разработка концепции статьи, получение и анализ фактических данных, написание и редактирование текста статьи, проверка и утверждение текста статьи.

Authors’ contribution. The authors declare the compliance of their authorship according to the international ICMJE criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Источник финансирования. Авторы декларируют отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The authors declare that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Об авторах

Олег Иванович Кит

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: onko-sekretar@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3061-6108

д-р мед. наук, проф., чл.-кор. РАН, ген. дир.

Россия, Ростов-на-Дону

Софья Владимировна Тимофеева

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Email: timofeeva.sophia@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5945-5961

Научный сотрудник лаборатории клеточных технологий

Россия, Ростов-на-Дону

Анастасия Олеговна Ситковская

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России

Email: grankina.anastasia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6035-1756

зав. лаб. клеточных технологий

Россия, Ростов-на-Дону

Инна Арнольдовна Новикова

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России

Email: novikovainna@yahoo.com
ORCID iD: 0000-0002-6496-9641

канд. мед. наук, зам. ген. дир. по науке

Россия, Ростов-на-Дону

Евгений Николаевич Колесников

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Минздрава России

Email: lkt-rnioi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8436-7250

канд. мед. наук, зав. отд-нием абдоминальной онкологии № 1 с группой рентгенэндоваскулярных методов диагностики и лечения

Россия, Ростов-на-Дону

Список литературы

Дополнительные файлы