Оценка устойчивости методики электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом при определении молекулярной массы белков на модели интерферона альфа-2b

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

Введение. Для оценки качества биологических лекарственных средств (БЛС) применяют различные условия электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом (ПААГ с ДСН), что обусловливает актуальность изучения устойчивости результатов оценки количественных показателей, например оценки молекулярной массы целевого белка, в зависимости от условий проведения испытаний.

Цель. Исследовать устойчивость результатов определения молекулярной массы белка методом электрофореза в ПААГ с ДСН при оценке подлинности, в том числе по изменению правильности, прецизионности и диапазона линейности, в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи Российской Федерации.

Материалы и методы. Электрофорез в восстанавливающих условиях проводили в условиях повторяемости два оператора в трис-глициновых гелях (три варианта концентрации) и в коммерческом бис-трис геле с использованием пяти наборов маркеров молекулярной массы и интерферона альфа-2b (ФСО.3.2.00455). Учет результатов осуществляли в программе ImageLab системы ChemiDoc. Для оценки устойчивости рассчитывали прецизионность и правильность результатов определения молекулярной массы.

Результаты. При оценке устойчивости результатов определения молекулярной массы интерферона альфа-2b методом электрофореза в ПААГ с ДСН выявлена вариабельность результатов в зависимости от состава используемого геля и набора маркеров молекулярной массы белка: относительное стандартное отклонение — RSD (прецизионность) результатов находилось в диапазоне от 0.6–0.9 до 8.5–8.6%, смещение относительно номинального значения молекулярной массы (правильность) — в диапазоне от 0.1–0.2 до 4.7–5.4 кДа.

Выводы. Выявленная при оценке устойчивости вариабельность результатов определения молекулярной массы интерферона альфа-2b свидетельствует о необходимости подтверждения правильности и прецизионности методики при внесении изменений в условия проведения электрофореза в отношении концентрации геля и набора маркеров молекулярной массы белков. Использование метода электрофореза в ПААГ с ДСН для оценки подлинности белка только по значению молекулярной массы без оценки соответствия стандартному образцу, аттестованному в установленном порядке, неинформативно.

Full Text

Restricted Access

About the authors

Наталья Леонидовна Иванютина

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Author for correspondence.
Email: ivanutina@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0002-4064-2484
Russian Federation, 127051, г. Москва, Петровский б-р, д. 8, стр. 2

Степан Игоревич Довбыш

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ivanutina@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0002-5506-4496
Russian Federation, 127051, г. Москва, Петровский б-р, д. 8, стр. 2

Виталина Витальевна Ножко

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ivanutina@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0002-2617-1479
Russian Federation, 127051, г. Москва, Петровский б-р, д. 8, стр. 2

Елизавета Викторовна Эльберт

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ivanutina@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0003-2737-948X

канд. биол. наук

Russian Federation, 127051, г. Москва, Петровский б-р, д. 8, стр. 2

Рауза Асхатовна Волкова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ivanutina@expmed.ru
ORCID iD: 0000-0001-8698-2890

д-р биол. наук

Russian Federation, 127051, г. Москва, Петровский б-р, д. 8, стр. 2

References

  1. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227 (5259). P. 680–685.
  2. Thomas R., Kurien B. Ultrarapid sodium dodecyl sulfate polyacrylamide mini-gel electrophoresis // Methods Mol. Biol. 2019. V. 1855. P. 491–494. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8793-1_42
  3. Krause R., Goldring D. Crystal violet stains proteins in SDS-PAGE gels and zymograms // Anal. Biochem. 2019. V. 566. P. 107–115. https://doi.org/10.1016/j.ab.2018.11.015
  4. Chubatsu L., Gerhardt E., Souza E. A simple preparation of prestained molecular markers for electrophoresis using inexpensive and readily available proteins // Anal. Biochem. 2023. V. 676. ID 115231. https://doi.org/10.1016/j.ab.2023.115231
  5. Томилин В. А., Иванютина Л. Н., Эльберт Е. В., Волкова Р. А. Оптимизация способов математической обработки калибровочных кривых при оценке молекулярной массы биологических лекарственных средств методом электрофореза в полиакриламидном геле с SDS // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017. Т. 17. № 3. С. 165–172. https://www.elibrary.ru/zgufnp
  6. Matsumoto H., Haniu H., Komori N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE // Methods Mol. Biol. 2019. V. 1855. P. 101–105. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8793-1_10
  7. Silva Neris R. L., Kaur A., Gomes A. V. Incorrect molecular weights due to inaccurate prestained protein molecular weight markers that are used for gel electrophoresis and western blotting // BioRxiv. 2020. N 4. ID 03.023465. https://doi.org/10.1101/2020.04.03.023465
  8. Волкова Р. А., Фадейкина О. В., Устинникова О. Б., Саркисян К. А., Мовсесянц А. А., Меркулов В. А., Косенко В. В. Требования к материалам раздела по стандартным образцам, представляемым в досье на биологические лекарственные средства // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024. Т. 24. № 1. С. 7–20. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-1-7-20].
  9. Меркулов В. А., Саканян Е. И., Волкова Р. А., Климов В. И., Шемерянкина Т. Б., Яшкир В. А. Фармакопейные стандартные образцы и практика их применения в отечественной системе стандартизации лекарственных средств // Хим.-фарм. журн. 2016. Т. 50. № 4. С. 40–43. https://doi.org/10.30906/0023-1134-2016-50-4-40-43 [Merkulov V. A., Sakanyan E. I., Volkova R. A., Klimov V. I., Shemeryankina T. B., Yashkir V. A. Pharmacopeia standard samples and their practical application in the national drug standardization system // Pharm. Chem. J. 2016. V. 50. N 4. P. 258–161. https://doi.org/10.1007/s11094-016-1433-y].
  10. Гегечкори В. И., Шатилина А. А., Шульга Н. А., Петухова Я. Д., Смирнов В. В., Раменская Г. В. Биологические стандартные образцы: актуальные вопросы разработки и порядка аттестации //Эталоны. Стандартные образцы. 2023. Т. 19. № 3. С. 21–29.
  11. Гайдерова Л. А., Лебедева Ю. Н., Лобанова Т. Н., Липатова Э. К., Волкова Р. А., Фадейкина О. В. Аттестация фармакопейного стандартного образца для оценки специфической активности рекомбинантного интерферона α-2b // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2024. Т. 24. № 1. С. 21–31. https://doi.org/10.30895/2221-996X-2024-24-1-21-31
  12. Haider S. R., Reid H. J., Sharp B. L. Tricine-SDS-PAGE // Electrophoretic separation of proteins / Eds B. Kurien, R. Scofield. New York: Humana Press; 2019. P. 151–160. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8793-1_15

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Typical electropherogram of proteins of different sets of molecular weight markers and interferon alpha-2b in 12% Tris-glycine polyacrylamide gel (the separating gel is shown in the image): a — in a gel measuring 16 × 20 cm; b — in a gel measuring 8.3 × 7.3 cm.

Download (643KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Determination of the molecular weight of interferon alpha-2b (mean and standard deviation) using different gels and different sets of molecular weight marker proteins.

Download (1MB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Molecular mass of interferon alpha-2b (box-and-whisker plot), calculated: a — in different types of gels, b — using a calibration graph based on different sets of molecular mass markers. Designation of gel types: T-12% — 12% Tris-glycine gels, T-14% — 14% Tris-glycine gels, T(4–20)% — Tris-glycine gels with a concentration gradient of 4–20%, B(4–12)% — Bis-Tris gels with a concentration gradient of 4–12%.

Download (50KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences