Vol 71, No 5 (2024): Генетическая инженерия растений – достижения и перспективы

Большой массив данных об экспрессии генов растений, накопленный благодаря сравнительным исследованиям, направляет усилия исследователей для изучения тонких механизмов влияния целевых генов и, как следствие, на разработку относительно простых и одновременно эффективных подходов, позволяющих понять физиологическую роль белковых продуктов гена. Многочисленные исследования убедительно продемонстрировали эффективность стратегии транзиентной экспрессии для характеристики функций генов растений. Цели обзора: (i) рассмотреть преимущества и ограничения различных растительных систем и методов временной экспрессии, используемых для выяснения роли генных продуктов; (ii) обобщить текущие данные об использовании подходов к временной экспрессии для понимания тонких механизмов, лежащих в основе функции генов; (iii) описать достижения в области эффективной временной экспрессии генов растений. В обзоре обсуждаются основные и критические этапы каждого из методов транзиентной экспрессии генов у растений, области их применения, а также основные результаты, полученные с использованием растительных объектов и их вклад в наши знания о тонких механизмах функций генов, лежащих в основе роста и развития растений, включая выяснение механизмов, регулирующих сложные метаболические пути.

Успехи генной инженерии способствовали возникновению нового раздела вакцинологии – создание рекомбинантных субъединичных вакцин, инициирующих формирование защитного иммунитета от различных заболеваний. Одной из перспективных и активно развивающихся систем экспрессии рекомбинантных белков медицинского назначения являются растения. В данном обзоре в общих чертах освещается формирование специфического и неспецифического иммунитета, функционирование гуморального и клеточного звеньев иммунитета, а также принципы создания рекомбинантных вакцинных препаратов. Более подробно рассматривается создание вакцинных препаратов для профилактики таких инфекций как грипп, коронавирусы, вирус папилломы человека, вирус гепатита В и норовирусы с примерами растительных рекомбинантных белков, профилактирующих эти заболевания. Дана оценка рынка рекомбинантных вакцин растительного происхождения и приведены примеры наиболее успешных из них. В целом обзор призван подчеркнуть актуальность растительных систем экспрессии для наработки рекомбинантных вакцинных препаратов и их возможности для быстрого реагирования на возникающие вызовы в области профилактики инфекционных заболеваний.

Пшеница мягкая (Triticum aestivum L.) – одна из самых важных зерновых и основных продовольственных культур во всем мире, выращиваемая довольно часто в засушливых регионах мира, где нехватка воды и засоление вызывают серьезные потери урожая. Ген TaNAC69 мягкой пшеницы кодирует один из важнейших транскрипционных факторов, который участвует в регуляции устойчивости к дефициту влаги, вызванной засухой и гипотермией, однако роль этого гена при засолении малоизучена. Целью данной работы было клонирование гена TaNAC69 мягкой пшеницы в бинарном векторе с 35S CaMV промотором и создание волосовидных корней (ВК) Nicotiana tabacum L. с конститутивной экспрессией гена TaNAC69 для оценки эффективности целевой генно-инженерной конструкции в условиях засоления. В ходе агробактериальной трансформации листовых дисков табака при помощи Agrobacterium rhizogenes были получены 15 линий культур ВК, в шести из которых было доказано наличие и высокий уровень экспрессии целевого гена. ВК табака с конститутивной экспрессией гена TaNAC69 характеризовались более быстрыми темпами роста, большей разветвленностью и большей сырой и сухой массой при действии 150 мМ NaCl, чем контрольные ВК табака без целевого гена. Анализ антиоксидантной системы выявил повышенную активность ферментов гваяколпероксидазы и глутатион-S-трансферазы, большее содержание пролина и водорастворимых сахаров, а также более высокую общую антиоксидантную способность в ВК с геном TaNAC69 по сравнению с нетрансформированным контролем. Генно-инженерная конструкция TaNAC69 с 35S CaMV промотором может быть рекомендована для генетической трансформации культурных растений с целью увеличения их устойчивости к абиотическому стрессу.

Метаболизм крахмала регулируется сложной каталитической сетью, одним из ключевых ферментов которой является пластидная крахмалфосфорилаза PHO1. В нашем исследовании с использованием системы CRISPR-Cas9 были получены растения табака (Nicotiana tabacum L.) с неполным нокаутом гена NtPHO1-L1 за счет делеционных вариантов каталитического домена белка NtPHO1-L1, приводящих к формированию нефункциональных форм фермента. Редактированные линии отличались от растений дикого типа повышенным накоплением крахмала и пониженным содержанием сахаров, хлорофиллов и каротиноидов в ткани листа. Показано, что в сравнении с контролем редактированные растения характеризовались дифференциальной экспрессией генов метаболизма крахмала (NtPHO1-L1, NtGWD, NtBAM1, NtBAM9, NtAI) и каротиноидов (NtPSY2, NtPDS, NtZDS, NtCRTISO, NtVDE), а также генов, кодирующих MADS-доменные транскрипционные факторы (NtFUL1, NtSEP1, NtSEP2, NtSEP3), которые предположительно участвуют в регуляции транскрипции исследуемых генов метаболизма. Предположено, что неполный нокаут NtPHO1-L1 приводит к изменению функциональной активности крахмалфосфорилазы табака. Это, в свою очередь, может влиять на скоординированную работу ферментов катаболизма крахмала, а также синтеза хлорофиллов и каротиноидов, возможно, за счет дифференциальной экспрессии MADS-box генов. Наши результаты подчеркивают критическую регуляторную роль пластидной крахмалфосфорилазы в метаболизме транзиторного крахмала, а также в стимулирующем влиянии на фотосинтез растения.

Генетическая трансформация rol-генами Agrobacterium rhizogenes приводит к многочисленным фенотипическим изменениям, в том числе к повышению стрессоустойчивости трансгенных растений. Механизмы стрессоустойчивости у растений, экспрессирующих rol-гены, остаются малоизученными, кроме того, фенотипические эффекты этих трансгенов зависят от того, из какого штамма агробактерий они происходят. Целью работы было создание трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L., несущих rol-гены штаммов A4, 15834 и K599 A. rhizogenes, анализ их стрессоустойчивости и состояния антиоксидантной системы. Трансгенные растения с rol-генами штаммов A4 и 15834 характеризовались увеличением скорости роста корней, как при нормальных условиях, так и при воздействии повышенных концентраций хлорида натрия и ацетата кадмия по сравнению с диким типом. Экспрессия rol-генов штамма К599 оказывала негативное действие на рост корней трансгенных растений табака как в норме, так и в стрессовых условиях засоления, гипотермии и повышенных концентрациях ацетата кадмия. В корнях трансгенных растений табака в оптимальных условиях и при засолении экспрессия rol-генов штаммов A4 и 15834 способствовала повышению количества общего растворимого белка, пролина, общего пула глутатиона и активности супероксиддисмутазы. В корнях трансгенных растений с rol-генами штамма К599 в условиях засоления обнаруживалось повышение активности супероксиддисмутазы, гваяколпероксидазы и глутатион-S-трансферазы. Таким образом, показано, что положительный эффект экспрессии rol-генов на рост корней трансгенных растений может быть связан с влиянием на различные компоненты антиоксидантной системы. Полученные нами результаты говорят о перспективности использования rol-генов штаммов А4 и 15834 A. rhizogenes для создания новых сортов и линий растений с улучшенными параметрами роста корней и повышенной стрессоустойчивостью, тогда как rol-гены штамма К599 не подходят для таких целей.