Clinical significance of the achievement of MRD-negativity in patients with chronic lymphocytic leukemia

Full Text

Введение Согласно критериям Всемирной организации здравоохранения, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) определяется как В-клеточная неоплазия из малых лимфоцитов, обычно коэкспрессирующих СD19, CD5 и СD23 [1]. Количество клональных В-лимфоцитов составляет более 5×109/л в периферической крови [2]. Это самая распространенная у взрослых гемопоэтическая опухоль, отличающаяся гетерогенным течением, которая преимущественно встречается у лиц пожилого возраста [3]. Диагностика заболевания основана на морфологии и иммунофенотипировании клеток крови и костного мозга [4, 5]. Подходы к терапии ХЛЛ претерпели за последние десятилетия значительную эволюцию. Первоначально терапия была симптоматической (хлорбутин, преднизолон) и не увеличивала продолжительность жизни пациентов. С появлением новых химиопрепаратов (флударабин, бендамустин), а также терапевтических моноклональных антител продолжительность жизни значимо увеличилась, что ассоциировалось с достижением полных клинико-гематологических ремиссий [6]. Стало ясно, что морфологическое исследование крови и костного мозга не позволяет адекватно оценить глубину ремиссии и требуются новые лабораторные методы для оценки минимальной остаточной болезни (МОБ). Кроме того, появились первые данные, что достижение элиминации МОБ коррелирует с увеличением общей (ОВ) и беспрогрессивной выживаемости (БПВ) пациентов [7, 8]. Эти факты повлияли на быстрое развитие лабораторных методик определения МОБ при ХЛЛ. Лабораторные методы определения МОБ при ХЛЛ Проточная цитометрия. Первоначально было предложено определение МОБ при ХЛЛ с помощью поиска популяции с аберрантной коэкспрессией СD19/CD5, а также моноклональности по легким цепям каппа/лямбда. Этот простой метод показал низкую специфичность ввиду наличия в небольшом количестве нормальных В-лимфоцитов с коэкспрессией CD19/CD5, что приводило к ложноположительным результатам, а также сложностью определения моноклональности на малых популяциях клеток, учитывая слабую экспрессию иммуноглобулина на ХЛЛ-клетках [9-11]. Чувствительность составила около 1%. Несмотря на недостаточную чувствительность, тем не менее метод используется для мониторинга течения заболевания, однако неприменим для оценки собственно МОБ. Значительным шагом явились предложенные A.Rawstron и соавт. подходы к стандартизации определения МОБ для 4-цветного проточного цитометра [12]. На большом количестве образцов крови и костного мозга было исследовано 50 возможных комбинаций для определения МОБ при ХЛЛ. Применялся метод разведения ХЛЛ-клеток в суспензии нормальных лимфоцитов для установления порога чувствительности, а также исследования образцов, содержащих ХЛЛ-клетки и кровь здоровых доноров, независимыми лабораториями по предложенному протоколу. Было выявлено 3 оптимальных по специфичности и чувствительности комбинации (CD5/CD19/CD20/CD38, CD5/CD19/CD81/CD22 и CD5/CD19/CD79b/CD43). В целом панель для 4-цветного цитометра выглядела следующим образом: sIgκ/sIgλ/CD19/CD5 CD45/CD14/CD19/CD3CD20/CD38/CD19/CD5CD81/CD22/ CD19/CD5CD79b/CD43/CD19/CD5 Первая пробирка служит для доказательства клональности, но не используется для количественного определения МОБ. В следующей пробирке определяются количество лейкоцитов по маркеру СD45 и контаминация популяции Т-клетками по маркеру CD3. Поскольку высокая контаминация Т-клетками (более 50 клеток) может привести к ложноположительным результатам, такие образцы не должны анализироваться. Подробно разработанная стандартная тактика гейтирования позволила резко поднять специфичность и чувствительность (специфичность 98,8%, чувствительность 91,1%). При этом в большинстве случаев исследователю не требовалось знать исходный фенотип ХЛЛ-клеток, что повышало применимость метода. Чувствительность достигала 0,01% (1:10 000, или 10-4) и была лимитирована количеством проанализированных клеток (событий). Поскольку для достоверного определения опухолевой популяции считалось необходимым наличие как минимум 50 аберрантных событий, требовалось проанализировать в каждой пробирке как минимум 500 000 лейкоцитов для достижения чувствительности 0,01% (1 на 10 000). Подробные рекомендации по практическому применению метода 4-цветной проточной цитометрии для диагностики МОБ ХЛЛ даны на сайте http://www.cll-mrd.org. Впоследствии с ростом технологий метод совершенствовался в направлении увеличения количества доступных флюорохромов и, соответственно, уменьшения количества пробирок, что ускоряет и удешевляет анализ. В частности, в 2012 г. A.Rawstron была предложена 6-цветная панель из 2 пробирок CD19/CD5/CD20 в сочетании с CD3/CD38/ CD79b (1) и CD81/CD22/CD43 (2) [13]. С переходом на 8-10-цветную цитометрию удалось сократить количество пробирок до единственной с использованием маркеров CD19, CD20, CD5, CD43, CD79b и CD81 [14]. Перечисленные 6 маркеров предлагалось дополнить следующими возможными парами: CD45, CD3 - для наиболее точного подсчета МОБ - или CD200 и СD23 - чтобы пользоваться одной панелью и для диагностики ХЛЛ и для определения МОБ ХЛЛ, или ввести новые маркеры, такие как СD160 и ROR1 [15, 16]. Использование единственной пробирки позволило увеличить количество собираемых событий и тем самым увеличить чувствительность метода до 0,001% (10-5). При этом лимитом детекции считалось наличие хотя бы 20 аберрантных событий, лимитом количественного определения - 50 аберрантных событий. То есть, чтобы достичь чувствительности 10-5, необходимо проанализировать 2 000 000 событий для детекции МОБ и 5 000 000 для количественного определения МОБ. Молекулярные методы выявления МОБ на основе полимеразной цепной реакции Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием стандартных (консенсусных) праймеров к генам вариабельной области тяжелых цепей иммунноглобулинов (IGHV) [17] - наиболее быстрая методика из молекулярных, имеет чувствительность около 10-2, но неприменима для всех пациентов. Ограничением чувствительности является амплификация нормальных поликлональных IGHV, особенно на фоне регенерирующего костного мозга. Метод является качественным. Значительно повысить чувствительность (10-5-10-6) позволила ПЦР с применением аллель-специфических праймеров [13, 14, 18]. Для этих методов необходимо иметь данные по исходному образцу (до терапии). Использование метода секвенирования в режиме реального времени [19] позволило добиться чувствительности до 10-5 с количественной оценкой МОБ. Наиболее чувствительными и быстрыми в настоящее время являются методы высокопроизводительного секвенирования нового поколения (чувствительность 10-6) [20, 21], позволяющие проводить количественную оценку МОБ, в том числе когда первичный материал недоступен. Имеются данные, что в ряде случаев глубина ремиссии, определяемая лишь столь высокочувствительными методами исследования (10-6 и ниже), коррелирует с достижением плато выживаемости и может служить оптимальной целью терапии. В частности, к такому выводу приводят исследования пациентов с ХЛЛ после аллогенной трансплантации [20], терапии CAR T-клетками [22], у которых МОБ-негативность, определенная методами секвенирования нового поколения, ассоциировалась с полным отсутствием неблагоприятных событий за время наблюдения, в отличие от МОБ-негативных по данным проточной цитометрии, в группе которых все же наблюдались случаи прогрессии. Оба метода обнаружения МОБ (ПЦР и проточная цитометрия) при сравнительном анализе показали высокую корреляцию результатов на уровне пороговой чувствительности до 10-5, однако при более низких значениях МОБ она выявляется лишь молекулярными методами [13, 18, 21]. Ограничением в использовании ПЦР-методов являются высокая стоимость реактивов и оборудования, трудозатратная методика выполнения анализа [13, 14, 18-21]. Преимуществом кроме высокой чувствительности является длительная стабильность ДНК, что упрощает транспортировку в центральную лабораторию. Проточная цитометрия быстрее в производстве и дешевле, недостатком является необходимость исследования свежих образцов (до 48 ч). Тем не менее метод проточной цитометрии в диагностике МОБ ХЛЛ благодаря стандартизации, эффективности и простоте получил широкое распространение [23, 24]. Сайт http://www.ericll.org (Европейская исследовательская инициатива по ХЛЛ) содержит актуальную информацию и рекомендации по определению МОБ при ХЛЛ как методом проточной цитометрии, так и ПЦР-методами. Материал для определения МОБ Определение МОБ возможно как в периферической крови, так и в костном мозге. Периферическая кровь значительно доступнее для анализа. При сравнении парных образцов отмечалась высокая корреляция, однако уровень МОБ в костном мозге, как правило, выше, чем в периферической крови [12-14, 18, 21]. Особенно это актуально в течение 3 мес после проведенной иммунохимиотерапии. В работе G.Kovacs и соавт. показано, что после терапии FCR значимо большую БПВ имели пациенты, у которых МОБ-негативность определялась как в крови, так и в костном мозге, в отличие тех, у которых МОБ определялась только в крови [25]. Итогом дискуссии о методах детекции МОБ стали следующие рекомендации Европейского медицинского агентства (2014 г.) [26]: для клинических исследований - проводить скрининговое исследование МОБ при ХЛЛ в периферической крови и в случае негативности обязательно проводить исследование костного мозга; МОБ-негативностью считается выявление менее 1 ХЛЛ-клетки на 10 000 лейкоцитов (<10-4). Два лабораторных метода считаются применимыми для определения МОБ-статуса - количественная ПЦР в режиме реального времени с чувствительностью в пределах 10-4-10-5 и ≥4-цветная проточная цитометрия с чувствительностью 10-4. Подобные рекомендации даны в руководстве National Cancer Institute-sponsored Working Group - NCI-WG (2008 г.) [4]. Возможным резервуаром МОБ при ХЛЛ могут служить лимфатические узлы и селезенка. Однако в настоящее время не разработаны методы детекции МОБ в этих локализациях [21]. Значение определения МОБ как прогностического фактора Частота и прогностическое значение элиминации МОБ для стандартных схем иммунохимиотерапии В 2011 г. была опубликована статья Sebastian Böttcher и соавт. [27] по результатам рандомизированного исследования CLL-8, в которой приведены данные по определению МОБ в периферической крови и костном мозге у 493 ранее не леченных больных, получивших курс терапии FC (флударабин, циклофосфан) и FCR (флударабин, циклофосфан, ритуксимаб). Схема FCR показала значительное преимущество перед FC в достижении МОБ-негативности (63% против 35% в периферической крови; p<0,001; 44% против 28% в костном мозге; p=0,007). Снижение уровня МОБ приводило к увеличению ОВ и БПВ в обеих группах пациентов (как при терапии FC, так и при терапии FCR), причем при достижении МОБ-негативности ОВ и БПВ не имели достоверных различий в обеих группах, хотя в группе пациентов, получивших терапию FCR, число пациентов, достигших МОБ-негативности, было достоверно выше. Таким образом, достижение МОБ-негативности являлось позитивным фактором, независимым от проведенной терапии. При мультифакторном анализе было показано, что МОБ-негативность в конце терапии является предиктором ОВ и БПВ, независимым от известных предшествующих терапии факторов риска. По данным исследования СLL10 (FCR и BR - бендамустин + ритуксимаб) достижение МОБ-негативности составило 74% против 63% соответственно в периферической крови и 46% и 35% соответственно в костном мозге [28]. B России было проведено многоцентровое исследование ВEN-001, куда включались ранее не леченные больные ХЛЛ с показаниями для начала терапии, без жестких критериев отбора, что приближено к рутинной клинической практике. Пациенты получали терапию по схеме BR. В исследование с 05.06.2012 по 20.01.2015 были включены 196 пациентов из 34 медицинских центров Российской Федерации, в популяцию для полного анализа включены 149. Статус МОБ был проанализирован методом проточной цитометрии у 84 (56,4%) больных, ответивших на терапию. Образцы костного мозга были исследованы у 81 (96,4%) пациента. МОБ-негативность после 6-го курса терапии составила 27,4%, что согласуется с данными мировой литературы [28, 29]. МОБ-статус и клинический ответ: что важнее? В исследовании Gabor Kovacs и соавт. [25] была проанализирована прогностическая значимость МОБ в сравнении с клиническим ответом на терапию у 554 ранее не леченных пациентов, включенных в 2 исследования: CLL8 (FC против FCR) и CLL10 (FCR против BR). МОБ измерялась методом проточной цитометрии с чувствительностью 10-4 в крови и в костном мозге (в костном мозге - только у пациентов с полной клинической ремиссией). Сравнивались 4 группы пациентов: с МОБ-негативной полной ремиссией (МОБ-ПР), МОБ-негативной частичной ремиссией (МОБ-ЧР), МОБ-позитивной полной ремиссией (МОБ+ПР) и МОБ-позитивной частичной ремиссией (МОБ+ЧР). Было установлено, что БПВ не различалась достоверно у пациентов с МОБ-ПР и МОБ-ЧР, что БПВ была достоверно выше у пациентов с МОБ-ЧР, чем у пациентов с МОБ+ПР. При более подробном анализе группы пациентов с МОБ-ЧР выяснилось, что только пациенты с изолированно увеличенной селезенкой имеют сходные результаты с группой МОБ-ПР, а в группе пациентов с увеличенными лимфоузлами БПВ была ниже. В целом результаты исследования показали, что для оценки эффективности терапии достижение МОБ-негативности не менее важно, чем клинический ответ, и оценка МОБ наряду с клиническим ответом должна применяться в рандомизированных клинических исследованиях. Одно из наиболее долгосрочных исследований влияния эрадикации МОБ на БПВ и ОВ описано в работе M.Kwok и соавт. [29]. Проанализированы данные 536 пациентов, получивших разные виды терапии ХЛЛ с 1996 по 2007 г. и достигших хотя бы частичной ремиссии. Срок наблюдения составил от 9 до 20 лет. БПВ и ОВ в группе МОБ-ЧР также была длиннее, чем у МОБ+ПР. Является ли МОБ-негативность универсальным предиктором прогноза? При мультивариантном анализе в работе M.Kwok и соавт. [29] на длительность БПВ влияли достижение МОБ-негативности и цитогенетические данные, а на ОВ - МОБ-статус, возраст, стадия и вид терапии. Те пациенты, которые достигли МОБ-негативности после первичной терапии, имели лучшие БПВ и ОВ, чем предлеченные, также наличие del17 и del11 снижало БПВ и ОВ, в том числе у МОБ-негативных пациентов, хотя они были несколько лучше, чем у МОБ-позитивных. Результаты долгосрочного наблюдения (16 лет) за пациентами, получившими стандартную терапию FCR, представлены в работе P.Thompson и соавт. [30]. Дан анализ ОВ и БПВ 300 пациентов в зависимости от разных факторов (мутационный статус, цитогенетика, уровень b2-микроглобулина, пола, стадии, достижение МОБ-негативности). МОБ определялась в костном мозге по окончании терапии методом пациент-специфической ПЦР (чувствительность 10-4). Одной из целей исследования были выявление факторов, влияющих на длительность БПВ и ОВ, и, соответственно, выделение групп пациентов с потенциально благоприятным прогнозом, не нуждающимся в эскалации терапии и поддерживающей терапии, или, напротив, тех, для которых стандартный терапевтический подход (FCR), скорее всего, окажется бесперспективен и, возможно, следует выбирать для лечения новые схемы. В частности, было установлено, что пациенты с мутированным статусом генов IGHV и достижением МОБ-негативности в конце терапии имеют значимо большие ОВ и БПВ, чем мутированные МОБ-позитивные. В группе немутированных пациентов достижение МОБ-негативности не влияло на ОВ и БПВ - они были значимо ниже, чем у мутированных. МОБ-негативность как точка окончания терапии: первые данные Интересным фактом являлось то, что, хотя пациенты, получившие по разным причинам (прежде всего из-за осложнений, связанных с токсичностью) меньше 6 циклов терапии, имели в целом худшую БПВ по сравнению с получившими все 6 циклов, если к моменту окончания терапии были достигнуты МОБ-негативность и полная ремиссия, БПВ не отличалась от получивших полный курс [31]. Это создало некоторые предпосылки для того, чтобы предположить, что пациентам, достигшим МОБ-негативности и полной клинической ремиссии, дальнейшая терапия может быть отменена, что даст возможность уменьшить токсические эффекты. Такое же предположение было выдвинуто Paolo Strati и соавт. [31] на основании анализа 237 ранее не леченных больных, получивших терапию FCR. Определение МОБ производилось в образцах костного мозга методом 4-цветной проточной цитометрии согласно стандартам ERIC [12] (чувствительность 10-4) после 3-го цикла терапии и через 2 мес после окончания терапии (6 циклов). Часть пациентов (50 человек) получили 3 и менее циклов терапии (в связи с миелосупрессией, сопутствующими заболеваниями и др.). По результатам достижения МОБ-негативности и количеству курсов терапии пациенты были разделены на 5 групп: 3 курса МОБ-, 3 курса МОБ+, пациенты МОБ- после 3-го цикла и продолжившие терапию до 6 циклов (3МОБ- 6МОБ-), 6 курсов МОБ+ и пациенты МОБ+ после 3-го курса и достигшие МОБ- после 6-го курса. По анализу БПВ и ОВ не было разницы между тремя МОБ-негативными группами, таким образом, продолжение терапии после достижения МОБ-негативности не улучшает выживаемость. Авторы отмечают, что раннее прекращение терапии после достижения эрадикации МОБ у больных с достижением полной ремиссии и без отягощающих прогностических факторов (с мутированным статусом генов IGHV и без del17) позволило бы уменьшить побочные эффекты терапии и, учитывая лимитированное количество наблюдений, предлагают проверить полученные данные в широком рандомизированном исследовании. Какие предтерапевтические факторы влияют на достижение МОБ-негативности? Существует некоторая разноречивость данных о том, какие характеристики больных, определяемые до начала терапии, влияют на достижение МОБ-негативности. Наиболее часто, хотя и не во всех работах, назывались такие факторы, как мутационный статус генов IGHV - чаще МОБ-негативность достигалась в группе мутированных [30-32] - и отсутствие del17p [27, 30]. Кроме того, в разных исследованиях отмечалось негативное значение таких факторов, как высокий уровень b2-микроглобулина [30], мужской пол [31], мутации NOTCH1 [32], а наличие трисомии 12 расценивалось как положительный фактор [32]. В исследовании BEN-001 не было выявлено статистически значимой корреляции между полом, возрастом, стадией заболевания, цитогенетическими данными, экспрессией CD38, IGHV-статусом и достижением МОБ-негативности после 6-го курса терапии BR в 1-й линии. МОБ-статус как конечная точка в клинических исследованиях Таким образом, по результатам приведенных выше наблюдений было доказано, что для стандартных схем иммуннохимиотерапии (FC, FCR, BR) МОБ-статус является предиктором ОВ и БПВ [25, 27-32]. На основании этого факта Европейское медицинское агентство рекомендовало использовать достижение МОБ-негативного статуса в качестве конечной точки для клинических исследований для доказательства влияния терапии на БПВ [26]. МОБ в эпоху новых препаратов Введение в практику новых препаратов - ингибиторов брутоновской тирозинкиназы (ибрутиниб) выявило такой феномен, как ибрутинибиндуцированный лимфоцитоз [33], который не препятствовал достижению положительного терапевтического эффекта. МОБ-негативность не достигалась, но отмечались уменьшение лимфатических узлов и нормализация показателей гемоглобина и тромбоцитов. Однако положительные эффекты сохранялись лишь на фоне постоянного приема препарата. В настоящее время проводится ряд многоцентровых исследований эффективности комбинации ибрутиниба с химиотерапией. В частности, в исследовании HELIOS зафиксировано преимущество комбинации ибрутиниб + BR над схемой BR для резистентных и рецидивных больных ХЛЛ. У них чаще достигалась МОБ-негативность, что ассоциировалось с лучшей БПВ [34]. В настоящее время проводится ряд исследований по оценке эффективности ибрутиниба в сочетании с другими препаратами (ибрутиниб и ритуксимаб [35], ибрутиниб и ублитуксимаб [36], ибрутиниб и алемтузумаб [37], ибрутиниб и венетоклакс [38]). Примечательно, что в дизайне этих исследований определение МОБ является не только критерием оценки эффективности терапии, но также возможной точкой окончания терапии при достижении МОБ-негативности. Ингибитор Bcl-2 венетоклакс показал свою эффективность у резистентных и рецидивных пациентов, изолированно и в сочетании с ритуксимабом, бендамустином, обинутузумабом. В частности, отмечалось достижение МОБ у 57% рефрактерных и рецидивных пациентов на терапии венетоклаксом и ритуксимабом [39]. Достижение МОБ-негативности в этих случаях также коррелировало с лучшей БПВ [40, 41]. Ряд исследований предлагают после химиотерапии проводить консолидационный курс моноклональными антителами (алемтузумаб [42], обинутузумаб [43]) до достижения МОБ-негативности в костном мозге. Результаты этих исследований, возможно, приведут к пониманию, у каких пациентов следует предпринимать все возможные шаги для достижения МОБ-негативности, а для каких групп пациентов неизбежные осложнения длительной терапии нивелируют потенциальный положительный эффект. Значение эрадикации МОБ при аллогенной трансплантации стволовых клеток В настоящее время, в связи с новыми возможностями терапии рецидивных и резистентных пациентов ХЛЛ, отмечается сужение показаний к аллогенной трансплантации стволовых клеток. Тем не менее в случае резистентности ко 2-й линии терапии, включая ибрутиниб и венетоклакс, возможность трансплантации должна быть рассмотрена для соматически сохранных больных [44]. Эрадикация МОБ при аллогенной трансплантации стволовых клеток достигается примерно в 1/2 случаев и служит предиктором длительной БПВ [20, 45, 46]. Исследование проводили через 6 и 12 мес после аллогенной трансплантации костного мозга. При сравнении метода проточной цитометрии (чувствительность 10-4) и ПЦР нового поколения (чувствительность 10-6) отмечалось некоторое преимущество последнего метода в оценке негативного влияния МОБ-позитивности на рецидив в посттрансплантационном периоде (50-месячная БПВ составила 93,3% при МОБ-негативности по ПЦР и 86% - по проточной цитометрии [20]). Однако в настоящее время нет рекомендации, что делать в случае рецидива МОБ после трансплантации. Имеются сведения об удачном применении инфузии донорских лимфоцитов в таких случаях [45], но число пациентов слишком мало, чтобы делать определенные выводы [21]. Использование определения МОБ в рутинной клинической практике Несмотря на то, что факт достижения эрадикации МОБ широко применяется в клинических исследованиях, до настоящего времени нет рекомендации определения уровня МОБ в клинической практике [4, 26, 47]. Нет работ, показывающих, как влияет эрадикация МОБ на качество жизни пациентов, также нет рекомендаций терапии рецидива МОБ. Однако ряд современных клинических исследований [31, 32, 35-37, 41, 42, 48, 49] подводит к выводу, что достижение МОБ-негативности может стать точкой окончания терапии, что позволит снизить токсичность, улучшить качество жизни и снизить стоимость терапии. Таким образом, определение МОБ-статуса может стать точкой принятия решения о продолжении, остановке либо смене терапии в клинической практике. Необходима разработка стандартов дизайна измерения МОБ для современных схем терапии, а также оптимальных методов исследования. Конфликт интересов Авторы заявляют, что конфликт интересов отсутствует. Информация о спонсорстве Исследование BEN-001 выполнено при спонсорской поддержке фирмы Astellas Pharma. Сведения об авторах Миролюбова Юлия Владимировна - врач клинической лабораторной диагностики, ассистент каф. лабораторной диагностики и генетики ФГБУ «НМИЦ им. В.А.Алмазова». E-mail: juli9702@yandex.ru Стадник Елена Александровна - канд. мед. наук, ФГБОУ ВО «Первый СПбГМУ им. И.П.Павлова», доц., ст. науч. сотр. ФГБУ «НМИЦ им. В.А.Алмазова». E-mail: elena_stadnik@mail.ru

About the authors

Yu V Mirolyubova

V.A.Almazov National Medical Research Center

Email: juli9702@yandex.ru
197341, Russian Federation, Saint Petersburg, ul. Akkuratova, 2

E A Stadnik

V.A.Almazov National Medical Research Center

Email: elena_stadnik@mail.ru
197341, Russian Federation, Saint Petersburg, ul. Akkuratova, 2

References

Supplementary files