ISSN (print): 0132-3423, ISSN (online): 1998-2860 Учредители: Российская академия наук, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Главный редактор: Кочетков Сергей Николаевич, академик РАН, д-р хим. наук, профессор Периодичность / доступ: 6 выпусков в год / подписка Входит в: Белый список (2 уровень), перечень ВАК, РИНЦ
Направляя рукопись статьи издателю для публикации в данном журнале, авторы соглашаются со следующим: авторы сохраняют за собой имущественные авторские права на произведение и предоставляют издателю исключительную лицензию на публикацию и распространение произведения; авторы сохраняют за собой право на распространение произведения в соответствии с условиями политики самоархивирования, принятой в журнале (см. подробнее); направляемая авторами в редакцию рукопись будет принята к публикации только по решению редакционной коллегии и главного редактора — в соответствии с правилами отбора контента в данном журнале (см. подробнее); опубликованное в журнале произведение будет распространяться в печатном и электронном виде по подписке или на условиях открытого доступа — по усмотрению издателя. Передаваемая авторами исключительная лицензия позволяет издателю использовать произведение следующими способами: воспроизведение Статьи, а также метаданных Статьи в любой материальной форме, в том числе на бумажном и/или электронном носителе в виде отдельного произведения и/или в составе Журнала, и/или базах данных Лицензиата и/или иных лиц, по усмотрению Лицензиата; распространение экземпляров Статьи, а также метаданных Статьи или иное отчуждение ее оригинала или экземпляров, в том числе на бумажном и/или электронном носителе в виде отдельного произведения и/или в составе Журнала, и/или базах данных Лицензиата и/или иных лиц, по усмотрению Лицензиата, в том числе распространение или иным способом использование Статьи или содержащихся в ней частей (фрагментов) для публикации в научных, учебных, технических или профессиональных журналах или других периодических изданиях и производных работах; в печатных и электронных версиях таких журналов, периодических изданий и производных работах во всех средствах и форматах, существующих на данный момент и которые могут возникнуть в будущем; доведение Статьи до всеобщего сведения таким образом, что любое лицо может получить доступ к Статье из любого места и в любое время по собственному выбору; переработка Статьи путем её перевода на иностранные языки по выбору Лицензиата, и использование переработанной (переведенной) Статьи вышеуказанными способами. Иные права, прямо не переданные издателю авторами, включая патентные права на любые процессы, способы или методы и прочее, описанные авторами в статье, а также права на товарные знаки, сохраняются за авторами. Подробности и детали изложены в типовом лицензионном договоре, который следует заполнить, заверить представителям авторского коллектива и направить издателю вместе с прочими материалами при подаче рукописи статьи на рассмотрение.
ПРЕДИСЛОВИЕ К СПЕЦИАЛЬНОМУ ВЫПУСКУ ЖУРНАЛА, ПОСВЯЩЕННОМУ 50-ЛЕТИЮ КАФЕДРЫ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА
СОВРЕМЕННЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ КАК ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ ВАЛИДАЦИИ КЛИНИЧЕСКИ ПЕРСПЕКТИВНЫХ Т-КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
Разработка терапевтических антиген-специфических Т-клеточных рецепторов (TCR) требует комплексной доклинической оценки их функциональной активности. Один из подходов при разработке новых препаратов для клеточной терапии на базе антиген-специфических Т-лимфоцитов заключается в модификации аутологичных Т-лимфоцитов эндогенными Т-клеточными рецепторами. В настоящей работе рассмотрены современные лабораторные платформы, применяемые для оценки ключевых характеристик TCR: формирования иммунологического синапса, специфичности связывания с антигеном и аффинности, активации сигнальных путей, продукции цитокинов и цитотоксического потенциала. Особое внимание уделено созданию модельных линий Т-клеток, экспрессирующих трансгенные TCR, оптимизации HLA-контекста клеток-мишеней и применению мультипараметрических технологий для анализа иммунного ответа. Обсуждаются перспективы использования 3D-органоидных моделей для оценки функциональной активности трансгенных TCR в условиях, приближенных к физиологическим, а также прогнозирования их клинической эффективности. Представленные подходы формируют основу для рационального отбора рецепторов-кандидатов в целях их последующего применения для иммунотерапии опухолей и лечения хронических инфекций.
ПОИСК И ИДЕНТИФИКАЦИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ РАСТЕНИЙ
Регуляторные пептиды растений – новый класс сигнальных молекул, играющих ведущую роль в регуляции роста, развития и стрессовых реакций растений. Благодаря высокой биологической активности при низких концентрациях, они рассматриваются как перспективные биостимуляторы для экологически безопасного растениеводства. В обзоре рассматриваются основные теоретические подходы и экспериментальные методы поиска и идентификации таких пептидов, включая масс-спектрометрию, биоинформатику, биотесты и in silico скрининг. Приводится обзор ключевых открытых пептидов, таких как системин, PSK, PSY, AtPep1, CLV3, TDIF, CEP, CIF, а также описываются методы их выделения, синтеза и функциональной валидации. Особое внимание уделяется модельным системам на основе культур клеток и проростков, применяемым для скрининга активности пептидов, а также подходам к идентификации соответствующих рецепторов. Авторы подчеркивают значение биотестов как ключевого этапа стратегий поиска, обеспечивающего функциональную оценку как идентифицированных, так и предсказанных (putative) пептидов.
РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ КАК МЕТОД ВАЛИДАЦИИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ В ЛЕЧЕНИИ ФИБРОЗА
РНК-интерференция (RNAi) – эволюционно консервативный механизм подавления экспрессии генов, основанный на деградации мРНК под действием малых интерферирующих РНК (siRNA). Открытие этого механизма стало не только мощным инструментом для фундаментальных исследований в биологии, но и открыло новые перспективы для терапевтической медицины. С точки зрения эффективности и безопасности терапия с помощью siRNA представляет собой многообещающую альтернативу традиционным фармацевтическим подходам. В отличие от традиционных фармакологических методов, которые часто характеризуются системной токсичностью и низкой специфичностью, терапия на основе siRNA позволяет селективно подавлять гены, ассоциированные с патологиями, обеспечивая высокоточное воздействие и низкую токсичность. Особый интерес представляет применение siRNA для модуляции активности макрофагов – ключевых эффекторов врожденного иммунитета, играющих центральную роль в развитии фиброза печени. Благодаря высокой пластичности макрофаги способны поляризоваться в провоспалительный (M1) или противовоспалительный (M2) фенотипы, что определяет их вклад в прогрессирование или регресс фиброза. Эпигенетические модификации и подавление ключевых регуляторов поляризации (таких как EGR2, IRF5, IRF3, TLR4, HAS2) с помощью siRNA позволяют целенаправленно изменять их функциональное состояние. В данном обзоре систематизированы современные данные о роли макрофагов в патогенезе фиброза печени и перспективах использования siRNA-терапии для управления их активностью. Обсуждаются стратегии прецизионного воздействия на ключевые молекулярные мишени, что открывает новые возможности для разработки патогенетически обоснованных методов лечения.
МАЛЫЕ НЕКОДИРУЮЩИЕ РНК – ГЛОБАЛЬНЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА БАКТЕРИЙ
Бактерии используют широкий спектр регуляторных систем, приспосабливаясь к жизни в различных условиях окружающей среды. Среди таких регуляторов важнейшее место занимают малые некодирующие РНК (нкРНК). Действуя преимущественно на посттранскрипционном уровне, малые нкРНК позволяют бактериям быстро корректировать экспрессию генов в ответ на внешние воздействия. Они участвуют в регуляции практически всех клеточных процессов, включая репликацию, транскрипцию, трансляцию, энергетический и общий метаболизм, устойчивость к антибиотикам, бактериальную вирулентность, а также в механизмах, связанных с бактериальным патогенезом. Бактериальные малые нкРНК способны опосредовать взаимодействие между бактериями и организмом хозяина, напрямую модулируя экспрессию эукариотических генов (чаще всего связанных с иммунным ответом). Таким образом, нкРНК служат универсальными и мощными регуляторными элементами, обеспечивающими выживание и активное функционирование бактерий в неблагоприятных условиях.
НЕКЛАССИЧЕСКИЕ КАННАБИНОИДНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ: СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ФУНКЦИЯХ И МЕХАНИЗМАХ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА
В обзоре обобщены современные представления о неклассических каннабиноидных рецепторах, их сигнальных механизмах и роли в физиологических и патологических процессах. Эти рецепторы (GPR55, GPR18, GPR119 и др.) характеризуются тканеспецифичной экспрессией, способностью взаимодействовать с различными G-белками и лиганд-зависимой активацией сигнальных путей. GPR55 участвует в регуляции боли, ангиогенеза и онкогенеза; GPR18 модулирует воспалительные и метаболические процессы; GPR119 рассматривается как перспективная мишень для терапии сахарного диабета. Установлена способность этих рецепторов к гетеродимеризации, что усложняет их фармакологический профиль. Неклассические каннабиноидные рецепторы представляют собой многообещающие мишени для лечения социально значимых заболеваний, таких как рак, диабет и нейродегенеративные патологии. Однако их контекст-зависимая активность требует дальнейших исследований для создания селективных терапевтических агентов.
8-ОКСО-2'-ДЕЗОКСИГУАНОЗИН – УПРАВЛЕНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕССОМ
8-Оксо-2'-дезоксигуанозин – известный маркер окислительного стресса. Исследования последнего десятилетия показывают, что это соединение, вероятно, не является побочным продуктом окислительного повреждения ДНК, а представляет собой важный биорегулятор, управляющий клеточным ответом на стресс. В данном обзоре собраны и проанализированы данные об участии 8-оксо-2'-дезоксигуанозина в процессах мутагенеза, репарации ДНК и регуляции экспрессии генов, воспалительных реакциях, адаптивном ответе на стресс, апоптозе и трансформации клеток. Особое внимание уделено потенциалу 8-оксо-2'-дезоксигуанозина в качестве терапевтического агента при воспалительных, аутоиммунных, дегенеративных и онкологических заболеваниях, а также травматических и токсических повреждениях.
Провоспалительный фенотип CD161+ дважды негативных Т-клеток
Дважды негативные (DN) CD3+CD4-CD8- T-лимфоциты представляют собой подгруппу неклассических периферических T-клеток. Хотя их представленность в периферической крови относительно невысока (3–5%), они играют важную роль при развитии воспалительных реакций, онкологических, аутоиммунных заболеваний и аллергической астмы. В настоящем исследовании мы охарактеризовали цитокиновый профиль CD3+CD4-CD8- DN T-клеток с помощью мультиплексной технологии с широкой панелью аналитов. Показано, что цитокиновый профиль провоспалительных αβTCR+CD161+ DN T-клеток включает цитокины TNFα, IFNγ, IL-3, IL-13 и IL-27, хемокины IL-8/CXCL8, MIG/CXCL9, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4 и RANTES/CCL5, а также факторы роста M-CSF и GM-CSF.
Трехпетельные токсины гадюк – клонирование кДНК и экспрессия в E. coli с использованием химерной (гибридной) конструкции с белком-партнером SUMO
Трехпетельные токсины (ТПТ) образуют одно из наиболее обширных семейств токсинов змеиных ядов. ТПТ характерны для большинства ядов аспид, но практически не встречаются в ядах гадюк. С использованием ядовитых желез гадюк Vipera nikolskii и V. berus был получен 21 клон кДНК, кодирующий эту группу токсинов. Из полученных последовательностей кДНК были выведены аминокислотные последовательности 9 ТПТ. Установленные последовательности имеют сигнальные пептиды, содержащие 19-21 аминокислотный остаток, за которыми следует зрелый белок, состоящий из 67 остатков. Все ТПТ гадюк относятся к группе нетрадиционных (non-conventional) токсинов, а их последовательности содержат 9 остатков цистеина. ТПТ, кодируемый одним из транскриптов, был получен гетерологической экспрессией в клетках E. coli в виде гибридного белка с растительным белком-партнером SUMO с последующим отщеплением специфичной растительной протеазой Bd-SENP1 и хроматографической очисткой. Структура полученного белка подтверждена методом масс-спектрометрии. Анализ его биологической активности показал, что этот токсин – слабый антагонист никотиновых холинорецепторов нейронного α7 и α3β2 подтипов. С использованием гибридного белка с SUMO мы также попытались получить ТПТ Aze-2 гадюки Azemiops feae, аминокислотная последовательность которого была установлена нами ранее в результате транскриптомного анализа ядовитой железы A. feae, а сам белок в минимальных количествах был идентифицирован в яде этой змеи. Однако токсин, точно соответствующий по массе Aze-2, с использованием этого подхода получить не удалось. Таким образом, в результате работы были установлены аминокислотные последовательности 9 ТПТ гадюк, один из которых был получен экспрессией гена в клетках E. coli и проявил способность взаимодействовать с никотиновыми холинорецепторами нейронного α7 и α3β2 подтипов.
ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕНОТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ ОХ40L С ПРИМЕНЕНИЕМ НЕВИРУСНОЙ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ В ОБОГАЩЕННЫХ ФИБРОБЛАСТАМИ МЫШИНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ МОДЕЛЯХ
Злокачественные опухоли при развитии способны формировать перииссивное микроокружение, влияющее на их дальнейший рост и развитие. Существенную роль в этом процессе играют опухоль-ассоциированные фибробласты. В настоящем исследовании мы использовали для создания подкожной мышиной опухоли инокуляцию совместной культуры раковых клеток и фибробластов для формирования опухолей, обогащенных клетками микроокружения. После формирования опухолевого узла проводили внутриопухолевое введение препарата, содержащего плазмиду с геном лиганда активирующих рецепторов иммунных контрольных точек ОХ40L под контролем промотора CMV. Для доставки в клетки плазмиду никапсулировали в полимерную оболочку на основе ПЭГ-ПЭИ-ТАТ. Мы оценивали влияние комплекса плазмиды, кодирующей ОХ40L, в поликатионной оболочке на рост опухолей. В предлагаемой модели мы искусственно обеспечивали присутствие фибробластов в опухоли, которые в определенной степени могут выполнять функцию развитого микроокружения. Опухоли, обогащенные фибробластами, как правило, обладали повышенной скоростью пролиферации. Однако при внутриопухолевом введении невирусного препарата, кодирующего ОХ40L, в такие опухоли мы наблюдали значительное увеличение количества животных с полностью регрессирующими опухолями, достигающего 25%. Предполагается, что введенные фибробласты могут выполвать антиген-презентирующую роль и/или служить дополнительным источником сигналов для активации иммунной системы.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ТРЕХПЕТЕЛЬНЫХ ТОКСИНОВ ЗМЕЙ И КРАСНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА
Визуализация макромолекулярных комплексов – важная задача современной биоорганической химии, которая может быть реализована с помощью различных методологических подходов. Наиболее широко используются методы с применением радиоактивно- и флуоресцентно-меченых лигандов. В рамках данного проекта разработаны молекулярные зонды, которые представляют собой гибридные конструкции, включающие один из трех змеиных токсинов (α-бунгаротоксин, α-кобратоксин или нейротоксин NT-II) в сочетании с красным флуоресцентным белком mKate2. Эти химерные белки были получены в бактериальной системе экспрессии и очищены с использованием гель-фильтрации. С помощью конкурентного радиолигандного анализа с радиоактивно-меченым α-бунгаротоксином установлено, что полученные зонды обладают высоким сродством к никотиновому ацетилхолиновому рецептору электрического органа ската Torpedo californica: значения концентраций полумаксимального ингибирования находятся в наномолярном диапазоне. Флуоресцентные зонды были успешно использованы для визуализации ацетилхолиновых рецепторов на поверхности клеток линии SH-SYSY.
ЦИТОСКЕЛЕТНЫЙ РЕГУЛЯТОР ЗИКСИН СТИМУЛИРУЕТ ТРАНСЛОКАЦИЮ ЭФФЕКТОРА HIPPO-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ – YAP – В ЯДРА КЛЕТОК ЭМБРИОНА ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ
На сегодняшний день в научной литературе представлено ограниченное число данных о взаимосвязи механотрансдукции, связанной с изменениями уровня зиксина, и биохимической передачи сигнала транскрипционного фактора YAP. Исследования в этой области предполагают, что стрессиндуцированная реорганизация активового цитокелета, опосредованная зиксином, может играть ключевую роль в механотрансдукции YAP. Вместе с тем эти работы не предоставляют четких результатов относительно влияния зиксина на распределение YAP между ядром и цитоплазмой и регуляцию его активности. В данной статье мы исследовали влияние зиксина на транслокацию эффектора Hippo-сигнального пути – YAP – в ядра клеток раннего эмбриона шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Анализ ядерно-цитоплазматического распределения YAP с помощью иммуноблоттинга и иммуногистохимического окрашивания в сочетании с подавлением трансляции эндогенной мРНК зиксина морфолиновыми антисмысловыми олигонуклеотидами и сверхэкспрессией синтетической мРНК зиксина выявил стимулирующее влияние зиксина на транслокацию YAP в ядра клеток эмбрионов на стадии гаструлы, но не на стадиях бластулы и нейрулы. Аналогичный вывод был сделан в результате анализа влияния тех же изменений концентрации зиксина на экспрессию YAP-зависимого люциферазного репортера. На основании результатов нашего исследования, а также принимая во внимание известную роль зиксина как одного из механотрансдукторов, можно предположить, что этот белок участвует в механозависимой регуляции сигнального пути Hippo в эмбриональном развитии X. laevis на стадии гаструляции.
ТРАНСКРИПТОМНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ УРОВНЯ ЦИТОСКЕЛЕТНОГО БЕЛКА ЗИКСИНА НА ПРОЦЕССЫ МЕТАБОЛИЗМА И СИГНАЛЬНЫЕ ПУТИ НА МОДЕЛИ ЭМБРИОНОВ ШПОРЦЕВОЙ ЛЯГУШКИ
Зиксин – белок цитоскелета, регулирующий сборку и восстановление активовых филаментов. Исследования, проведенные в нашей лаборатории на модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis, показали, что зиксин играет важную роль в регуляции экспрессии генов и клеточной дифференцировке. В работах последних лет мы получили интересные данные, указывающие на способность этого механочувствительного белка участвовать в механизмах, связывающих морфогенетические движения с экспрессией генов, ответственных за формирование осевых структур и стволового статуса клеток в самом сложном процессе в жизни любого организма – эмбриогенезе. В этой статье мы представляем последние полученные результаты по поиску генов, сигнальных путей и биологических процессов, которые регулируются с участием зиксина. Для исследования было использовано высокопроизводительное секвенирование пулов мРНК из клеток эмбрионов X. laevis на стадии нейрулы с нормальной, повышенной и подавленной при помощи морфолиновых олигонуклеотидов функцией зиксина. Использование биоинформатического анализа позволило выделить из большого числа генов зиксин-зависимые сигнальные пути и биологические процессы, важные для эмбриогенеза. Показано, что подавление зиксина приводит к изменению в экспрессии генов-участников более 16 сигнальных каскадов и влияет на 27 биологических процессов, из которых наиболее выраженные связаны с морфогенезом и генной экспрессией. Результаты работы имеют прежде всего фундаментальное значение. Изучение роли зиксина в передаче сигналов от механических стимулов к аппарату генной экспрессии важно для изучения координации биомеханики и дифференцировки в ходе эмбриогенеза, а в перспективе предоставляет возможность использования зиксина в качестве потенциального диагностического маркера для ряда заболеваний.
АДРЕСНЫЕ НАНОЛИПОСОМЫ, ЗАГРУЖЕННЫЕ КРАСИТЕЛЕМ IR780, КАК МУЛЬТИФУНКЦИОНАЛЬНАЯ НАНОПЛАТФОРМА ДЛЯ ФОТОТЕРМИЧЕСКОЙ И ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РАКА
При лечении раковых заболеваний комбинированное действие фототермической и фотодинамической терапии обладает уникальными преимуществами по сравнению с каждым из этих методов в отдельности. В данном исследовании разработана многофункциональная адресная наноплатформа для одновременной комбинированной фототермической и фотодинамической терапии при облучении инфракрасным лазером 808 нм. Разработанная система представляет собой липосомы размером ~140 нм, специфичные к опухоль-ассоциированному антигену HER2 и загруженные гептаметинцианиновым красителем ближнего инфракрасного диапазона IR780. Тропность липосом к HER2 определяется HER2-специфичным скаффолдным белком DARPin_9-29 на внешней поверхности липосом. Установлено, что, находясь в составе липосом, IR780 сохраняет фототермические и фотодинамические свойства: под действием облучения в растворе липосом, загруженных IR780, происходит быстрое повышение температуры раствора (до 60°C за 60 с), а также идет выработка активных форм кислорода. В опытах in vitro установлено, что HER2-специфичные липосомы, содержащие IR780, обладают фотоиндуцированной цитотоксичностью в отношении HER2-суперэкспрессирующих клеток, вызывая гибель 50% клеточной популяции при концентрации 2.85 мкМ. Результаты исследования позволяют заключить, что HER2-специфичные липосомы, содержащие IR780, обладают отличными таргетными характеристиками, а IR780 может использоваться в качестве действующего вещества для одновременной фототермической и фотодинамической терапии.
РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНТРАКРАНИАЛЬНОЙ PDX-МОДЕЛИ ГЛИОБЛАСТОМЫ ЧЕЛОВЕКА В МЫШАХ NSG
Разработка ортотопической интракраниальной модели на основе клеточной культуры глиобластомы человека в иммунодефицитных мышах – важная задача как для изучения инвазивности и агрессивности поведения опухолевых клеток, так и для создания надежной модели для оценки эффективности новых препаратов для терапии глиобластомы. В данной работе было проведено сравнительное исследование линейных (U87MG) и первичных клеток глиобластомы, полученных от пациента (культура 022), при подкожной и ортотопической интракраниальной ксенотрансплантации иммунодефицитным мышам линии NSG. Было показано, что в обоих группах животных с ортотопическими ксенотрансплантатами опухоли росли как вглубь мозговой ткани, так и на поверхности мозга, а в случае первичной культуры 022 отмечен также рост в сторону желудочков. Нелинейные клетки имели эпителиоидный вид, тогда как клетки U87MG имели более саркоматоидный вид. При этом клеточная линия U87MG была туморотенна в обоих локализациях. Однако, первичная культура 022 формировала опухоли только при интракраниальной, но не при подкожной ксенотрансплантации, что указывает на нейроспецифичность данной модели. Следовательно, она может служить более релевантной моделью глиобластомы по сравнению с моделью на основе клеточной линии U87MG.
РАЗРАБОТКА БАКТЕРИАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕМСОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ НЕЙРОГЛОБИНА И ЦИТОХРОМА С В МЕЧЕННОЙ СТАБИЛЬНЫМИ ИЗОТОПАМИ 15N/13C ФОРМЕ
Разработана эффективная система продукции изотопно-меченых гемсодержащих белков нейроглобина и цитохрома с человека. Получены соответствующие штаммы-продуценты, подобраны оптимальные условия культивирования: температура и продолжительность инкубации, состав сред, концентрация индуктора экспрессии. С помощью КД-спектроскопии в дальней и ближней УФ-видимой областях показано, что состав вторичной структуры 15N-нейроглобина близок к расчетному, а ориентация гема в молекулах преимущественно каноническая. Согласно двумерным 1Н/15N-HSQC спектрам ЯМР нейроглобина и цитохрома с человека, белки свернуты в нативную конформацию с преобладанием α-спиральной структуры. Полученная система продукции может быть использована для наработки высокоочищенных препаратов тотально 15N/13C-меченых белков для проведения структурно-динамических исследований с использованием современных методов ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.
СВОЙСТВА КАЛИЕВОГО КАНАЛА Kv1.1 НА ОСНОВЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО ДИМЕРА АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦ mKate2-Kv1.1-Kv1.1 В КЛЕТКАХ NEURO-2A
Изучены свойства потенциал-зависимого калиевого канала Kv1.1, сформированного в клетках Neuro-2a из димеров α-субъединиц Kv1.1 человека, соединенных дипептидом Lys-Leu и слитых по N-концу с флуоресцентным белком mKate2 (mKate2-(Kv1.1)2). Установлено, что объединение α-субъединиц Kv1.1 в димер не повлияло на уровень мембранной экспрессии канала и характер его клеточного распределения по сравнению с мономерами mKate2-Kv1.1. Для каналов на основе димеров mKate2-(Kv1.1)2 и мономеров mKate2-Kv1.1 не выявлено отличий в потенциале полуактивации, константах активации канала, величинах и характере токов ионов калия. Полученные данные указывают на возможность создания аналогичным способом биоинженерных белковых конструкций, объединяющих две разные α-субъединицы, которые обеспечат в клетках млекопитающих формирование флуоресцирующих гетеротетрамерных потенциал-зависимых калиевых каналов со стехиометрией α-субъединиц 2 : 2.
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА К РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНОМУ АНТИГЕНУ PRAME
Антиген PRAME (Preferentially expressed Antigen in Melanoma), относящийся к группе раковотестикулярных антигенов и экспрессирующийся в различных типах опухолей, представляет собой привлекательную мишень для направленной терапии онкологических заболеваний. В данной работе на основе моноклонального антитела 6Н8 к белку PRAME было получено гуманизированное антитело 6Н8Нu, которое было наработано в клетках CHO. Было показано, что гуманизированное антитело сохраняет высокую аффинность родительского мАТ по отношению к антигену (1.2 нМ), связывается как с рекомбинантным, так и с нативным белком PRAME, оказывает ингибирующее действие на пролиферацию PRAME+ клеточной линий меланомы человека Mel Ibr, а также ингибирует рост опухолевых узлов in vivo в степени, сравнимой с действием мышиного антитела 6Н8 и цитостатика мелфалана.
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ
Клеточная гетерогенность – черта глиобластомы, злокачественной и агрессивной опухоли головного мозга, и одна из причин неэффективности стандартных методов лечения, вероятно, возникающая из-за дифференцировки опухолевых стволовых клеток. Причины повышенных адаптивных способностей и устойчивости клеток глиобластомы к лекарственным препаратам и стрессу заложены на уровне молекулярных процессов. По этой причине в данной работе с помощью ПЦР в реальном времени была проведена оценка изменения экспрессии генов транскрипционных факторов MYCN, MYCC, PHOX2A и PHOX2B, задействованных в регуляции клеточного цикла и дифференцировки, в ответ на изменение условий культивирования. В результате работы было показано, что в среде с эмбриональной бычьей сывороткой первичные культуры по экспрессии генов и морфологии клеток становятся похожи на клеточные линии. Кроме того, впервые было показано, что все клеточные линии и первичные культуры глиобластомы отличаются профилями экспрессии исследованных генов, однако в ответ на изменение условий культивирования для всех свойственно многократное увеличение экспрессии MYCN, а также противоположный ответ PHOX2A и PHOX2B, что указывает на возможную роль этих генов в устойчивости глиобластомы к стрессу. Полученные данные стоит учитывать при подборе индивидуального лечения для пациентов, а также при разработке терапевтических агентов и дальнейшем исследовании молекулярных процессов в клетках глиобластомы.
ПЕРОРАЛЬНЫЕ ДОБАВКИ ИНДОЛ-3-АЦЕТАТА УВЕЛИЧИВАЮТ ПРЕДСТАВЛЕННОСТЬ Bifidobacterium pseudolongum И Akkermansia muciniphila В КИШЕЧНИКЕ МЫШЕЙ НА ВЫСОКОЖИРОВОЙ ДИЕТЕ
Известно, что даже непродолжительная диета с высоким содержанием жиров оказывает негативное влияние на метаболическое здоровье холоорганизма. Однако, под воздействием рациона, в первую очередь, претерпевает изменения микробиота кишечника. Тип диеты, биологически активные добавки и лекарственные препараты оказывают влияние как на таксономическое разнообразие микробиоты, так и на ее функциональное состояние. Известно, что при участии кишечной микробиоты триптофан подвергается превращению в индол и его различные производные. Также установлена ведущая роль индолов в регуляции экспрессии белков плотных контактов, а соответственно регуляции проницаемости кишечника. Целью нашего исследования была оценка влияния индол-3-ацетата на таксономическое разнообразие микробиоты тонкой и толстой кишки, а также установление потенциальной пребиотической ценности данного индольного производного в условиях кратковременного применения высокожировой диеты. Мыши C57/black6 SPF в возрасте 4–5 недель ( = 60, самки) случайным образом были распределены на шесть групп. Высокожировая диета была достигнута путем кормления лабораторных животных кормом с высоким содержанием жиров животного происхождения и обеспечивающей до 30% от общего количества калорий. Индол-3-ацетат применяли вместе со стандартной или высокожировой диетой через атраматический внутрижелудочный зонд в разовой дозе 0,1392 мг на мышь в течение 28 дней. В нашем исследовании впервые было показано, что у мышей C57/black6 SPF на кратковременной высокожировой диете индол-3-ацетат повышает представленность Bifidobacterium pseudolongum в микробном сообществе как тонкой кишки, так и толстой кишки. Тогда как повышение Akkermansia muciniphila было только в микробном сообществе толстой кишки. Прием индол-3-ацетата обеспечивает нормогликемию у животных на кратковременной высокожировой диете. Применение индол-3-ацетата при различных метаболических заболеваниях ассоциированных с высокожировой диетой и дисбактериозом может быть перспективным терапевтическим подходом к коррекции нарушений метаболизма через модуляцию микробиотического сообщества.
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИИ В ГЕНЕ Stk11 В ЛИНИИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЛЕГКОГО МЫШИ LLC1 НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К РАДИОТЕРАПИИ ЧАСТИЦАМИ
Аденокарцинома легкого – это злокачественная опухоль, наиболее распространенная разновидность немелкоклеточного рака легких. Низкая эффективность стандартных методов лечения аденокарциномы легкого с мутацией гена-онкосупрессора Stk11 представляет серьезную проблему в клинической практике. Поиск и совершенствование новых терапевтических подходов для данного заболевания остается актуальной задачей современной биомедицины. Цель работы – создание модели рака легкого in vitro на основе клеточной линии LLC1 с нокаутом гена Stk11 для оценки чувствительности мутантных клеток к различным видам лучевой терапии, включая облучение фотонами, протонами и нейтронами. В качестве основных методов использовали технологии геномного редактирования CRISPR/Cas9 для получения мутантных клонов, лазерную сортировку клеток, ПЦР-анализ для подтверждения делеции, а также оценку жизнеспособности, пролиферации (метаболические тесты, экспрессия маркера Mki67), индукции апоптоза (метод аннексин V-PI) и экспрессии гена Pten после облучения клеток дозой 2 Гр. В результате были получены гетерозиготные мутантные линии LLC1-STK11-Mut. Облучение клеток выявило, что у мутантных по Stk11 клеток радиоиндуцированная стимуляция роста сохранялась дольше, чем у клеток дикого типа, а также наблюдалось значительное увеличение доли поздних апоптотических и некротических клеток. При этом экспрессия Mki67 временно снижалась после облучения, но быстро восстанавливалась у мутантных клеток, что свидетельствует об их более высокой радиорезистентности. В отличие от клеток дикого типа, у мутантных клеток уровень экспрессии гена Pten после облучения существенно не изменялся. Таким образом, мутация Stk11 способствует формированию радиорезистентности опухолевых клеток за счет запуска различных адаптационных механизмов. Полученная in vitro модель может использоваться для дальнейшего изучения радиорезистентности и разработки новых подходов к терапии опухолей с мутацией STK11.
ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВОГО СОСТАВА МЕМБРАНЫ Exiguobacterium sibiricum ПРИ ПОНИЖЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ: ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ
Впервые проведен анализ белков мембранной фракции психротрофной бактерии Exiguobacterium sibiricum методом безметочной количественной хромато-масс-спектрометрии. При сравнении образцов из клеток, культивировавшихся при 10°С и при комнатной температуре, обнаружены существенные отличия в содержании многих белков, осуществляющих важнейшие физиологические процессы, включая ДНК- и РНК-связывающие белки, мембранные транспортеры, белки, обеспечивающие защиту от осмотического и окислительного стресса, и др. Результаты работы позволяют уточнить механизмы процессов, протекающих в мембранах клеток психротрофных бактерий при низких температурах, и дополняют существующие представления о стратегиях адаптации микроорганизмов, обитающих в многолетнемерзлых отложениях. Полученные данные также могут быть использованы для поиска потенциальных биокатализаторов, обладающих активностью при низких температурах.
ПЕПТИД NLS УЛУЧШАЕТ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДОСТАВКИ пДНК В ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ КАТИОННЫМИ ЛИПОСОМАМИ
Получены обычные и мультифункциональные катионные липосомы, эффективно доставляющие плазмидную ДНК (пДНК). Показано частичное ингибирование рецептор-опосредованного эндоцитоза комплексов пДНК с мультифункциональными катионными липосомами, содержащими фолатные липиды, в присутствии свободной фолиевой кислоты в клеточной среде. Дополнительное формирование комплексов пДНК с пептидом сигнала ядерной локализации (NLS) позволило увеличить эффективность экспрессии улучшенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в 1.5–2 раза с использованием обычных и мультифункциональных катионных липосом. Добавление пептида NLS к пДНК и дальнейшее формирование комплексов с катионными липосомами может быть использовано для решения проблемы эффективной доставки пДНК в эукариотические клетки.
ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА PAPC НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ Pichia pastoris
Дрожжи Pichia pastoris (Komagataella phaffii) нашли широкое применение в пищевой и фармацевтической промышленности как микробные клеточные фабрики рекомбинантных белков за способность к гетерологической сверхэкспрессии многих целевых белков, в том числе протеолитических ферментов. Протеаза-активатор протеина С (PAPC) плазмы крови из микромицета Aspergillus ochraceus VKM F-4104D потенциально может быть внедрена в терапевтическую практику в качестве фибринолитического лекарственного средства, а также в диагностические системы для анализа свертываемости крови в роли основного компонента, активирующего протеин С. Для решения задач по применению протеазы-активатора протеина С в медицине и ветеринарии важно иметь надежную систему продукции рекомбинантного фермента. Такая система продукции может быть создана на основе дрожжей. Цель данной работы заключалась в создании штамма-продуцента PAPC на основе дрожжей P. pastoris и демонстрации успешной продукции и секреции протеолитического фермента в культуральную жидкость. Нами был сконструирован вектор, несущий ген papc. Этим вектором были трансформированы дрожжи P. pastoris, проведена селекция трансформантов на среде, содержащей антибиотик зеоцин. При помощи селекции на агаризованной среде с казеином, а также анализа культуральной жидкости методом белкового электрофореза в ПААГ были отобраны наиболее эффективные клоны-продуценты целевого фермента. Исследована динамика накопления активной формы PAPC в культуральной жидкости после индукции белкового синтеза при глубинном культивировании продуцирующего клона в колбе. LC-MS-анализ подтвердил присутствие фермента в культуральной среде, а также показал, что его накопление происходит в зрелой ферментативно активной форме. Полученный в результате работы штамм-продуцент может быть использован для дальнейшего получения экспериментальных промышленных партий фермента на биотехнологических производствах, поддерживающих проведение дрожжевой ферментации.
ИОНИЗИРУЕМЫЙ КАТИОННЫЙ ЛИПИД ДЛЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ДОСТАВКИ РНК
Ключевой компонент липидной платформы наночастиц для РНК-терапии – ионизируемые липиды. Они обеспечивают эффективную сборку комплекса липидов с нуклеиновой кислотой, ее защиту от преждевременной деградации, а после эндоцитоза способствуют выходу РНК в цитоплазму для дальнейшего процессинга. В работе описан синтез нового ионизируемого катионного липида на основе диглицеридного производного третичного алкиламина – [5-[1,2-ди(деканоилокси)пропан-3-илокси]пентил-(4-гидроксибутил)-амино]пентокси]-2-деканоилоксипропил]деканоат (An-1). Синтез отличается простотой и экономичностью применения реагентов. В сравнительных экспериментах с известным ионизируемым липидом ALC-0315 показано, что липид An-1 формирует сходные по размерам и эффективности включения модельной мРНК липидные наночастицы (ЛНЧ). ЛНЧ с мРНК зеленого флуоресцентного белка на основе липида An-1 эффективнее трансфицировали клетки в культуре по сравнению с ЛНЧ на основе липида ALC-0315. Предполагается, что новый ионизируемый липид может найти применение в производстве мРНК-вакцин.